MAT法熱原檢測中，非內(nèi)毒素?zé)嵩∟EP）對照品設(shè)為 “選做”，且試劑盒不默認(rèn)配備，需結(jié)合檢測需求靈活使用，背后有明確的設(shè)置邏輯。首先，試劑盒開發(fā)階段已通過驗(yàn)證（用多種 NEP 配體刺激細(xì)胞），證明其可檢出 NEP，后期實(shí)驗(yàn)是否加入 NEP 對照，只需根據(jù)內(nèi)部管理要求或專業(yè)人員建議確定，無需強(qiáng)制設(shè)置；若產(chǎn)品產(chǎn)線明確無 NEP 污染風(fēng)險（如只使用革蘭氏陰性菌原料），可刪除 NEP 對照，簡化操作。其次，試劑盒不配備 NEP 對照品，是因不同用戶需求差異大 —— 部分用戶需檢測特定 NEP（如脂磷壁酸），部分需檢測廣譜 NEP，因此提供單獨(dú)購買選項，用戶可按需選擇，避免資源浪費(fèi)。NEP 對照品的主要使用場景包括：一是方法驗(yàn)證階段，用于確認(rèn)試劑盒對 NEP 的響應(yīng)性；二是產(chǎn)品工藝變更后，排查是否引入 NEP 污染；三是歐盟申報時，需證明方法可覆蓋 NEP，此時需加入 NEP 對照品并顯示陽性結(jié)果。若樣品檢測中 NEP 對照品陽性，而樣品檢測陰性，可排除 NEP 污染；若樣品陽性，則需進(jìn)一步鑒定熱原類型。

MAT法熱原檢測中，獲得標(biāo)準(zhǔn) S 型標(biāo)曲需通過顯色時機(jī)控制與圖形調(diào)整實(shí)現(xiàn)，確保標(biāo)曲擬合準(zhǔn)確。在顯色時機(jī)控制上，加入 TMB 底物后，孔內(nèi)顏色會逐漸變藍(lán)，且隨反應(yīng)時間加深，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度呈現(xiàn)明顯藍(lán)色差異（如高濃度孔深藍(lán)色、低濃度孔淺藍(lán)色）時，即可加入終止液；若儀器含 600nm 波長，可在終止前檢測高濃度標(biāo)準(zhǔn)品的 OD600nm 值，當(dāng)達(dá)到 1.0 左右時終止，此時顯色反應(yīng)處于線性期，終止后顏色由藍(lán)變黃，信號強(qiáng)度約增強(qiáng) 3 倍，易形成 S 型曲線。在圖形調(diào)整上，若標(biāo)曲擬合后未呈現(xiàn)明顯 S 型，可通過調(diào)整坐標(biāo)軸范圍優(yōu)化—如將縱軸（OD 值）范圍設(shè)為 0-2.5，橫軸（熱原濃度）設(shè)為對數(shù)坐標(biāo)，突出低濃度區(qū)的拐點(diǎn)與高濃度區(qū)的平臺區(qū)，使曲線更接近 S 型。此外，標(biāo)曲配制需確保濃度點(diǎn)單獨(dú)配制（非連續(xù)稀釋），避免高濃度標(biāo)準(zhǔn)品污染低濃度點(diǎn)，導(dǎo)致低濃度區(qū)信號異常升高，破壞 S 型曲線形態(tài)。通過以上方法，可有效提升 S 型標(biāo)曲的成功率，保障熱原定量的準(zhǔn)確性。

單核細(xì)胞系憑借標(biāo)準(zhǔn)化、可控性等優(yōu)勢，有效解決PBMC（外周血單個核細(xì)胞）在熱原檢測中的局限。其一，單核細(xì)胞系源自永生化細(xì)胞株（如 Mono-Mac-6），經(jīng)篩選后細(xì)胞特性高度均一，消除供體差異，讓熱原檢測結(jié)果穩(wěn)定性大幅提升。其二，其培養(yǎng)過程可控，培養(yǎng)基配方與環(huán)境（溫度、CO?濃度）可準(zhǔn)確調(diào)控，能維持細(xì)胞好的活性，避免 PBMC 因分選、凍存導(dǎo)致的活性衰減。其三，對培養(yǎng)環(huán)境波動耐受性更強(qiáng)，可保障細(xì)胞遺傳穩(wěn)定且無污染物風(fēng)險，降低熱原檢測的操作復(fù)雜度與誤差率。

熱原是指微量即可引發(fā)恒溫動物體溫異常升高的物質(zhì)，分為內(nèi)源性（如細(xì)胞因子）與外源性兩類，外源性熱原又涵蓋微生物來源（革蘭氏陰性菌脂多糖 LPS、革蘭氏陽性菌脂磷壁酸 LTA、病毒、真菌等）與非微生物來源（灰塵、橡膠降解產(chǎn)物等）。傳統(tǒng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（BET）只能檢測革蘭氏陰性菌的 LPS，無法覆蓋非內(nèi)毒素?zé)嵩鴨魏思?xì)胞活化試驗(yàn)（MAT）可彌補(bǔ)這一缺陷。其原理是：熱原通過活化單核細(xì)胞表面的 Toll 樣受體（TLR，如 TLR4 識別 LPS、TLR2/TLR6 識別 LTA），啟動先天免疫反應(yīng)，促使細(xì)胞釋放 IL-6、TNF-α 等促炎細(xì)胞因子；隨后采用 ELISA 法檢測 IL-6 濃度，結(jié)合 LPS 標(biāo)準(zhǔn)曲線推算樣品中總熱原含量，實(shí)現(xiàn)對內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩耐綑z測，契合《中國藥典》9301 指導(dǎo)原則中 全場景防控?zé)嵩L(fēng)險”的要求。

MAT 法與傳統(tǒng)家兔法在熱原檢測中，性能差異明顯，MAT 法在準(zhǔn)確性、效率與合規(guī)性上更具優(yōu)勢。從結(jié)果評判來看，MAT 法以 “加標(biāo)回收率 50%-200%、供試品濃度 < 規(guī)定限值（CLC）” 為合格標(biāo)準(zhǔn)，靈敏度達(dá) 0.0125EU/mL，可準(zhǔn)確定量熱原濃度；而家兔法只能定性（觀察體溫升高），靈敏度低（約 0.1-0.5EU/mL），易因家兔個體差異（如免疫狀態(tài)、應(yīng)激反應(yīng)）導(dǎo)致假陰性。從檢測效率來看，MAT 法樣品與細(xì)胞共培養(yǎng) 24 小時即可出結(jié)果，且可批量檢測（96 孔板一次處理多個樣品）；家兔法需連續(xù)觀察 72 小時，每次只能檢測少量樣品，耗時且人力成本高。從合規(guī)性來看，MAT 法不使用動物，符合 3R 原則，已被歐盟接受（EP 刪除家兔法）；家兔法因動物實(shí)驗(yàn)屬性，面臨歐盟等地區(qū)的法規(guī)限制。此外，MAT 法重復(fù)性優(yōu)（復(fù)孔 CV 可控制在 30% 以內(nèi)），家兔法因個體差異 CV 常超 50%，進(jìn)一步凸顯 MAT 法在現(xiàn)代熱原檢測中的優(yōu)勢。