在單核細(xì)胞活化試驗(yàn)（MAT）的熱原檢測(cè)中，IL-6 被確定為關(guān)鍵檢測(cè)指標(biāo)，而非 IL-1β 或 TNF-α，主要源于其在穩(wěn)定性、生物學(xué)關(guān)聯(lián)性及商業(yè)化應(yīng)用上的優(yōu)勢(shì)。從穩(wěn)定性來(lái)看，IL-6 在體外培養(yǎng)環(huán)境中受個(gè)體免疫狀態(tài)影響較小，半衰期更長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性更優(yōu)，且檢測(cè)靈敏度高，能準(zhǔn)確定量熱原污染水平；而 TNF-α 和 IL-1β 產(chǎn)生時(shí)間短、表達(dá)量低，還易被蛋白酶降解，導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)波動(dòng)大，難以標(biāo)準(zhǔn)化。從生物學(xué)特性而言，IL-6 是先天免疫反應(yīng)的炎癥介質(zhì)，可通過(guò)活化 JAK-STAT 和 NF-κB 通路驅(qū)動(dòng)急性期反應(yīng)，如誘導(dǎo)大腦產(chǎn)生前列腺素 E2（PGE2）觸發(fā)發(fā)熱，與熱原的致熱機(jī)制直接關(guān)聯(lián)，是公認(rèn)的發(fā)熱標(biāo)志物。同時(shí)，MAT 法熱原檢測(cè)會(huì)輔以 IL-1β 和 TNF-α 監(jiān)測(cè) ——IL-1β 反映單核細(xì)胞活化程度，TNF-α 提示炎癥放大效應(yīng)，形成多因子協(xié)同體系。此外，IL-6 的 ELISA 試劑盒市場(chǎng)成熟度高、跨平臺(tái)兼容性強(qiáng)，而 IL-1β 和 TNF-α 的檢測(cè)方法在靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)化上仍有局限，進(jìn)一步奠定了 IL-6 的重要地位。

相較于傳統(tǒng)家兔法，熱原檢測(cè)MAT法在動(dòng)物福利、檢測(cè)性能、適用范圍等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。從動(dòng)物福利看，MAT法使用分離培養(yǎng)的單核細(xì)胞系（如湖州申科 HL-60 細(xì)胞系），無(wú)需動(dòng)物，完全符合 “減少、替代、優(yōu)化” 的 3R 原則，規(guī)避家兔法的倫理爭(zhēng)議與飼養(yǎng)成本。檢測(cè)性能上，家兔法只能定性且靈敏度低（檢測(cè)限≥5EU/kg），結(jié)果受動(dòng)物個(gè)體差異、環(huán)境溫度影響大；MAT 法可定量檢測(cè)，標(biāo)曲線性范圍 0.0125-1.0EU/mL，檢測(cè)限（LOD）達(dá) 0.0125EU/mL，批間 CV≤25%，重復(fù)性更優(yōu)。適用范圍方面，家兔法不適用于放射性質(zhì)藥物、基因療法制劑等可能影響動(dòng)物體溫的產(chǎn)品；MAT法適配疫苗、血制品、抗體藥、化藥等幾乎所有類型樣品，且支持高通量檢測(cè)，單塊 96 孔板可同時(shí)分析多個(gè)樣品，檢測(cè)時(shí)間從家兔法的3-7天縮短至1.5天，大幅提升效率。

MAT 法熱原檢測(cè)中，細(xì)胞傳代的代次控制是保障檢測(cè)穩(wěn)定性的關(guān)鍵，需結(jié)合細(xì)胞特性與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)制定標(biāo)準(zhǔn)。參考行業(yè)文獻(xiàn)，單核細(xì)胞系（如 HL-60、THP1）的使用代次通常不超過(guò) 20 代，代次過(guò)高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)特性改變：一是 TLR 受體表達(dá)下降，如 TLR4 表達(dá)量在 20 代后下降 40%，導(dǎo)致內(nèi)毒素檢測(cè)靈敏度降低；二是細(xì)胞倍增時(shí)間延長(zhǎng)，從 24 小時(shí)延長(zhǎng)至 36 小時(shí)，影響共培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的準(zhǔn)確性；三是炎癥因子分泌減少，IL-6 分泌量在 20 代后下降 35%，導(dǎo)致熱原濃度低估。申科對(duì)配套的 HL-60 細(xì)胞系進(jìn)行代次穩(wěn)定性驗(yàn)證，結(jié)果顯示：1-15 代細(xì)胞的熱原響應(yīng)性一致（加標(biāo)回收率 85%-125%），16-20 代回收率波動(dòng)至 70%-130%，21 代后回收率 < 70%，因此建議控制在 1-15 代使用。實(shí)驗(yàn)室需建立細(xì)胞代次記錄制度，每傳代 1 次記錄代次，達(dá)到 15 代后及時(shí)更換新批次細(xì)胞，并驗(yàn)證新批次細(xì)胞與舊批次的一致性（如檢測(cè)同一樣品，結(jié)果偏差≤20%），確保不同代次細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定。

生物制品（如單克隆抗體、重組蛋白、細(xì)胞因子）因基質(zhì)成分復(fù)雜（含高濃度蛋白質(zhì)、螯合劑、表面活性劑、緩沖鹽等），在熱原檢測(cè)過(guò)程中易出現(xiàn)“反應(yīng)抑制”或“非特異性增強(qiáng)”現(xiàn)象，嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。選擇抗干擾能力更強(qiáng)的檢測(cè)方法至關(guān)重要，重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR）因采用完整級(jí)聯(lián)反應(yīng)路徑，抗干擾性優(yōu)于天然 LAL；單核細(xì)胞活化反應(yīng)測(cè)定（MAT）對(duì)復(fù)雜基質(zhì)耐受性更高，通過(guò)適當(dāng)稀釋即可消除多數(shù)干擾，因此生物制品熱原檢測(cè)常采用 “rCR 法（內(nèi)毒素定量）+ MAT 法（全熱原篩查）” 的聯(lián)合方案，既保證內(nèi)毒素檢測(cè)的準(zhǔn)確性，又防控非內(nèi)毒素?zé)嵩L(fēng)險(xiǎn)。

一次合格的 MAT 法熱原檢測(cè)，需同時(shí)滿足 “合格標(biāo)曲” 與 “合格樣品檢測(cè)值及回收率” 兩大關(guān)鍵條件。合格標(biāo)曲需具備四要素：一是良好線性，采用 4-Parameter Logistic 擬合，R2 需接近 1.0，避免線性不佳導(dǎo)致定量偏差；二是良好信號(hào)值，各濃度點(diǎn) OD 值需呈梯度變化，高濃度點(diǎn) OD 值需足夠（如上限濃度 OD600 達(dá) 1.0 左右），信號(hào)過(guò)低會(huì)影響靈敏度；三是良好 CV，復(fù)孔間 CV 需控制在合理范圍（定量限內(nèi)≤25%、定量上下限≤30%），確保重復(fù)性；四是良好背景值，陰性對(duì)照 OD 值需低于標(biāo)曲下限濃度點(diǎn) 10%，排除外源污染。合格樣品檢測(cè)值則需滿足加標(biāo)回收率在 50%-200%，例如文檔中某樣品 10 倍稀釋回收率 41.3%（不合格），20 倍 71.3%（接近合格），40 倍 97.7%（合格），需在 MVD 范圍內(nèi)調(diào)整稀釋倍數(shù)，同時(shí)樣品熱原濃度需低于規(guī)定限值（CLC），方可判定樣品符合要求。

MAT 法熱原檢測(cè)標(biāo)曲采用非倍比稀釋，而非 1-0.5-0.25 的倍比稀釋，主要優(yōu)勢(shì)在于提升標(biāo)曲準(zhǔn)確性與適用性，避免稀釋誤差影響。一是可密集覆蓋關(guān)鍵濃度區(qū)間：熱原檢測(cè)的重點(diǎn)關(guān)注區(qū)為低濃度拐點(diǎn)（如 0.0125-0.1EU/mL）與高濃度平臺(tái)區(qū)（如 0.5-1EU/mL），非倍比稀釋可在這些區(qū)間設(shè)置更多濃度點(diǎn)（如 0.0125、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1EU/mL），提升曲線擬合精度，而倍比稀釋低濃度點(diǎn)少，易導(dǎo)致低濃度熱原定量不準(zhǔn)。二是降低稀釋誤差累積：倍比稀釋需連續(xù)稀釋（如 1EU/mL→0.5EU/mL→0.25EU/mL），每一步誤差會(huì)累積，導(dǎo)致低濃度點(diǎn)實(shí)際濃度偏離理論值；非倍比稀釋通過(guò)單獨(dú)配制每個(gè)濃度點(diǎn)（如直接用標(biāo)準(zhǔn)品配制 0.025EU/mL），避免誤差累積，提升標(biāo)曲可靠性。三是適配不同樣品濃度：非倍比稀釋可根據(jù)樣品預(yù)期濃度調(diào)整標(biāo)曲范圍，如樣品預(yù)期濃度 0.05EU/mL，可增加 0.025、0.05、0.1EU/mL 點(diǎn)，確保樣品濃度落在標(biāo)曲線性區(qū)，而倍比稀釋范圍固定，靈活性差。這些優(yōu)勢(shì)使非倍比稀釋成為 MAT 法標(biāo)曲配制的優(yōu)先選擇方式。