法規(guī)推薦的抗體覆蓋率評估方法主要分為兩類：一類是傳統(tǒng) 2D-WB 法，另一類是基于抗體親和的免疫捕獲類方法。傳統(tǒng) 2D-WB 法存在諸多不足，如需對蛋白進(jìn)行變性處理、樣品需前處理（會破壞蛋白天然表位）、轉(zhuǎn)膜效率較低、易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)等，因此難以準(zhǔn)確反映真實(shí)的覆蓋率水平。湖州申科自主研發(fā)了免疫磁珠捕獲分離技術(shù)（immunomagnetic beads separation，IMBS），該技術(shù)借助免疫磁珠的半液態(tài)特性，能在懸浮狀態(tài)下與 HCP 樣本充分混勻并結(jié)合；整個過程中蛋白無需變性，且結(jié)合方式與 ELISA 檢測條件相近，從而可獲得更貼近真實(shí)情況的覆蓋率結(jié)果。

LC-MS技術(shù)作為生物制品宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測的新趨勢，應(yīng)用時需重點(diǎn)考慮以下五方面：①穩(wěn)定性：需對HCPs的LC-MS檢測流程開展驗(yàn)證，全流程需實(shí)施嚴(yán)格QC管控，以保障檢測結(jié)果的一致性與穩(wěn)定性。②可重復(fù)性：不同類型生物制品中HCPs的提取效率存在差異，且不同人員操作會產(chǎn)生偏差，因此需在上機(jī)前通過多種方法評估HCPs提取效率，規(guī)避人為因素導(dǎo)致的結(jié)果重復(fù)性不佳問題。③準(zhǔn)確度：在方法開發(fā)與驗(yàn)證階段，需設(shè)置內(nèi)標(biāo)并確定定量算法，通過內(nèi)標(biāo)響應(yīng)回算得出HCPs含量，以此保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。④抗干擾能力：高豐度蛋白與特殊基質(zhì)會干擾質(zhì)譜檢測，需借助前處理手段去除高豐度蛋白或特殊基質(zhì)，從而降低其對HCPs肽段質(zhì)譜檢測的影響。⑤真實(shí)性：樣品中除HCPs外的其他物質(zhì)在質(zhì)譜分析中也會產(chǎn)生質(zhì)譜信號，需去除復(fù)雜背景噪音以避免假陽性與假陰性情況，同時建立規(guī)范的生信分析流程。在分析流程搭建過程中，同樣需制定嚴(yán)格的QC標(biāo)準(zhǔn)，并通過后續(xù)多種方法驗(yàn)證，明確該標(biāo)準(zhǔn)的真實(shí)性。

定制化試劑盒之所以成為宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測的優(yōu)先選擇，關(guān)鍵原因之一是其構(gòu)建的檢測體系更契合商業(yè)化生產(chǎn)中HCP工藝雜質(zhì)的控制需求。在HCP校準(zhǔn)品與HCP抗體這兩大關(guān)鍵試劑組分達(dá)標(biāo)后，定制化方法的建立與優(yōu)化會依托真實(shí)的純化中間品及原液樣品開展——通過優(yōu)化檢測條件提升對低濃度HCP的檢測靈敏度，從而滿足工藝驗(yàn)證與過程控制的需求。臨床三期階段需對生產(chǎn)工藝開展系統(tǒng)驗(yàn)證，以保障其穩(wěn)定性與可重復(fù)性，而定制化HCPELISA檢測方法能更準(zhǔn)確地監(jiān)測工藝中HCP的去除效果，為工藝驗(yàn)證提供堅(jiān)實(shí)支撐。過程控制環(huán)節(jié)，借助工藝特異型HCP ELISA檢測方法，可實(shí)時監(jiān)測生產(chǎn)過程中的HCP水平，擁有更強(qiáng)的生產(chǎn)異常預(yù)警能力，能及時排查生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，保障產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。

湖州申科生物專注于研發(fā)貼合實(shí)際生產(chǎn)工藝的商業(yè)化宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測試劑盒，依托不同工藝下 HCP 的差異化分析，針對性推出各細(xì)分工藝領(lǐng)域的 HCP 檢測試劑盒。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示：針對 CHO-S 與 CHO-K1 兩種宿主細(xì)胞，兩類細(xì)胞共享 2458 種相同 HCP（占比 79.7%），但各自存在 392 種和 236 種特異性 HCP，充分體現(xiàn)工藝差異帶來的殘留蛋白特異性。進(jìn)一步對比 B3 表達(dá)菌與 K2 克隆菌，盡管二者共享 1489 種相同蛋白（分別占比 88% 和 85%），但仍各自檢出 208 種和 258 種獨(dú)有蛋白，差異率為 12%-15%。這些結(jié)果直接證實(shí)，不同工藝路線與克隆株選擇會影響 HCP 殘留譜的構(gòu)成。據(jù)此，湖州申科提出 “工藝定制化檢測” 策略：通過準(zhǔn)確識別共性與特異性 HCP，針對性研發(fā)細(xì)分試劑盒產(chǎn)品。

宿主細(xì)胞蛋白（HCP）ELISA 定制化開發(fā)平臺需具備完善的開發(fā)體系、可靠的技術(shù)平臺與專業(yè)的開發(fā)團(tuán)隊(duì)，以此實(shí)現(xiàn)長期穩(wěn)定供應(yīng)符合法規(guī)要求的試劑盒。其中，校準(zhǔn)品作為關(guān)鍵原材料，其良好的穩(wěn)定性與溯源保障對試劑盒生命周期至關(guān)重要。為確保校準(zhǔn)品穩(wěn)定，通常采用凍干工藝制備，通過單因素方差分析方法評估其均一性，并依據(jù)法規(guī)規(guī)定的蛋白定量方法為校準(zhǔn)品賦值，同時溯源至國家標(biāo)準(zhǔn)品（如有）或 BSA 國家標(biāo)準(zhǔn)品，從源頭保障檢測的準(zhǔn)確性與合規(guī)性，為后續(xù)檢測體系的可靠運(yùn)行奠定基礎(chǔ)。

美國藥典 USP 通則 <1132.1>《質(zhì)譜法測定生物藥中殘留宿主細(xì)胞蛋白》（Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry），主要內(nèi)容是介紹 LC-MS 技術(shù)在宿主細(xì)胞殘留蛋白檢測中的應(yīng)用。該通則圍繞樣品制備、質(zhì)譜測試條件建立、數(shù)據(jù)分析、質(zhì)譜方法驗(yàn)證等維度，詳細(xì)說明質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于 HCPs 檢測的優(yōu)勢及需注意的事項(xiàng)。作為先進(jìn)的分析技術(shù)平臺，質(zhì)譜技術(shù)在 HCPs 分析中的應(yīng)用，無論是單獨(dú)使用，還是與 ELISA 及其他分析方法聯(lián)合使用，都能幫助生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品全生命周期中更清晰地理解并建立 HCPs 檢測方法，進(jìn)而保障產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。