MAT法（單核細(xì)胞活化反應(yīng)測(cè)定）熱原檢測(cè)基于人體免疫反應(yīng)機(jī)制設(shè)計(jì)，原理是：內(nèi)毒素（革蘭氏陰性菌來(lái)源）與非內(nèi)毒素?zé)嵩ǜ锾m氏陽(yáng)性菌、霉菌、病毒等來(lái)源）進(jìn)入人體后，會(huì)活化單核細(xì)胞或單核細(xì)胞系，使其釋放 IL-6、IL-1、IL-1β、TNF-α 等促炎細(xì)胞因子。檢測(cè)時(shí)將供試品與單核細(xì)胞 / 單核細(xì)胞系共孵育，再通過(guò) ELISA 定量檢測(cè)釋放的 IL-6 含量，結(jié)合內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)曲，即可判斷供試品中熱原含量是否符合規(guī)定，實(shí)現(xiàn)內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩娜采w檢測(cè)。

MAT 法熱原檢測(cè)的關(guān)鍵機(jī)制是 “熱原活化單核細(xì)胞 TLR 受體，觸發(fā)炎癥因子分泌”，TLR 受體的全覆蓋是保障檢測(cè)無(wú)遺漏的關(guān)鍵。不同熱原需活化不同 TLR 受體：最常見的內(nèi)毒素（LPS）主要活化 TLR4，而革蘭氏陽(yáng)性菌的非內(nèi)毒素?zé)嵩ㄈ缰妆谒幔┬杌罨?TLR2/6，真菌多糖活化?TLR2/4，病毒核酸活化 TLR3/7/8 等。因此，MAT 試劑盒配套細(xì)胞需具備全覆蓋的 TLR 受體表達(dá)—湖州申科生物通過(guò) Western blot 驗(yàn)證，其 HL-60 細(xì)胞系表達(dá) TLR1-TLR9，可響應(yīng)各類熱原。為進(jìn)一步驗(yàn)證覆蓋能力，申科用不同非內(nèi)毒素?zé)嵩潴w（如脂磷壁酸、酵母多糖）刺激細(xì)胞，結(jié)果顯示所有配體均能誘導(dǎo) IL-6 分泌，且呈良好量效關(guān)系，證明試劑盒可檢出各類熱原。若細(xì)胞 TLR 受體覆蓋不全（如缺失 TLR2），則無(wú)法檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性菌的非內(nèi)毒素?zé)嵩?，?dǎo)致漏檢風(fēng)險(xiǎn)，因此 TLR 受體的全覆蓋是 MAT 法熱原檢測(cè)的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)之一。

MAT法熱原檢測(cè)中，樣品與細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)需嚴(yán)格控制，以保障炎癥因子分泌量穩(wěn)定。說(shuō)明書要求共培養(yǎng) 24 小時(shí)，雖未明確允差，但實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示，±30 分鐘的允差對(duì)結(jié)果無(wú)明顯影響 —— 細(xì)胞因子（如 IL-6）分泌具有時(shí)間依賴性，24 小時(shí)左右達(dá)到分泌平臺(tái)期，半小時(shí)差異不會(huì)導(dǎo)致分泌量大幅波動(dòng)。若實(shí)驗(yàn)室對(duì)結(jié)果穩(wěn)定性要求極高（如 QC 放行檢測(cè)），建議嚴(yán)格按 24 小時(shí)操作，避免因時(shí)長(zhǎng)差異引入誤差；若為預(yù)實(shí)驗(yàn)（如樣品稀釋倍數(shù)摸索），±30 分鐘允差可接受，但需在記錄中注明實(shí)際培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)。需注意的是，共培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)不可超過(guò) 26 小時(shí)或短于 22 小時(shí)：過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性下降（炎癥因子分泌減少），過(guò)短則未達(dá)分泌平臺(tái)期（檢測(cè)信號(hào)偏低），均可能導(dǎo)致熱原濃度低估。此外，培養(yǎng)環(huán)境需保持穩(wěn)定（37℃、5% CO?），溫度波動(dòng)會(huì)影響細(xì)胞代謝，間接導(dǎo)致共培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的實(shí)際效果偏離，因此需定期校準(zhǔn)培養(yǎng)箱溫度，確保環(huán)境條件一致。

中國(guó)藥典對(duì) MAT 法熱原檢測(cè)要求 4 復(fù)孔，未明確 CV 限值，需結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)特性合理解讀與操作。藥典不設(shè) CV 限值的主要原因是：MAT 法基于細(xì)胞反應(yīng)，細(xì)胞活性易受環(huán)境微小變化（如溫度、pH）影響，存在天然不穩(wěn)定性，過(guò)嚴(yán)的 CV 要求可能脫離實(shí)際；但實(shí)驗(yàn)室可通過(guò)積累多批次數(shù)據(jù)，制定內(nèi)部 CV 控制范圍（如定量上下限 CV≤30%、25%），確保檢測(cè)重復(fù)性。關(guān)于 3 復(fù)孔的適用性：若長(zhǎng)期數(shù)據(jù)顯示 CV 控制良好（如連續(xù) 10 批次 CV<20%），且樣品為中間過(guò)程檢測(cè)（非 QC 放行），可嘗試 3 復(fù)孔，但需同步設(shè)置加標(biāo)對(duì)照，驗(yàn)證結(jié)果可靠性；若為 QC 放行檢測(cè)，仍建議按 4 復(fù)孔操作，符合藥典下限要求。對(duì)于異常點(diǎn)處理，可采用狄克遜準(zhǔn)則（Q 檢驗(yàn)）等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 —— 如某復(fù)孔 IL-6 檢測(cè)值偏離平均值 30% 以上，且無(wú)明顯操作誤差（如加樣錯(cuò)誤），可判定為異常點(diǎn)并剔除，但需在原始記錄中詳細(xì)說(shuō)明原因，確保數(shù)據(jù)可追溯，避免隨意剔除導(dǎo)致結(jié)果失真。

PyroSHENTEK^®熱原檢測(cè)試劑盒（貨號(hào) 1502100，規(guī)格 96 測(cè)試 / 盒）優(yōu)勢(shì)在于搭載 MAT 特定單核細(xì)胞系，細(xì)胞表面表達(dá)多種 Toll 樣受體（TLR），可響應(yīng)不同類型熱原。該細(xì)胞系來(lái)源清晰、可溯源，均一性強(qiáng)且無(wú)供體依賴，有效規(guī)避了傳統(tǒng) PBMC 因供體差異導(dǎo)致的結(jié)果波動(dòng)，同時(shí)安全風(fēng)險(xiǎn)低，無(wú)需擔(dān)憂外源因子污染。試劑盒采用 “標(biāo)準(zhǔn)化單核細(xì)胞 + ELISA 檢測(cè)” 一體化體系，通過(guò)嚴(yán)格的細(xì)胞質(zhì)量控制（如凍存復(fù)融后活率達(dá)標(biāo)），確保每次檢測(cè)的細(xì)胞狀態(tài)一致；搭配預(yù)包被 IL-6 抗體的酶標(biāo)板與配套試劑，進(jìn)一步減少體系誤差。從標(biāo)曲數(shù)據(jù)來(lái)看，其擬合采用 4-Parameter Logistic 模型，R2 達(dá) 1.000，EC50 為 0.119EU/mL，參數(shù)置信區(qū)間穩(wěn)定，復(fù)孔結(jié)果重復(fù)性優(yōu)異，能為熱原定量提供準(zhǔn)確如一的數(shù)據(jù)支撐，避免因體系不穩(wěn)定導(dǎo)致的檢測(cè)偏差。

家兔熱原試驗(yàn)作為熱原檢測(cè)領(lǐng)域的 “法定傳統(tǒng)方法”，被中國(guó)藥典（ChP）、美國(guó)藥典（USP）、歐洲藥典（EP）均列為法定檢測(cè)項(xiàng)目，其主要優(yōu)勢(shì)在于可通過(guò)家兔體溫應(yīng)答篩查所有類型熱原，尤其適用于無(wú)法排除非內(nèi)毒素?zé)嵩廴镜母唢L(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品，如血液制品、放射性質(zhì)藥物及部分生物制劑。然而，家兔熱原試驗(yàn)存在明顯局限：動(dòng)物個(gè)體差異大，需額外投入時(shí)間與成本篩選合格家兔；檢測(cè)周期長(zhǎng)（至少 6 小時(shí)），無(wú)法滿足生物制品快速放行需求；靈敏度較低（對(duì) LPS 檢測(cè)限≥5EU/kg），與全球倡導(dǎo)的“動(dòng)物福利3R原則”背道而馳。