在宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測的分析方法里，ELISA法應(yīng)用較多，也是QC日常放行檢測的主要方式。該方法操作相對簡便、檢測精度較好，便于設(shè)定控制范圍與制定技術(shù)規(guī)范，適用于產(chǎn)品開發(fā)及過程控制；不過，ELISA檢測依賴抗原與抗體的特異性結(jié)合，因此以生物制品中HCP為免疫原制備的抗體質(zhì)量，對檢測結(jié)果影響極大。無論是市售ELISA試劑盒，還是實(shí)驗(yàn)室自制的多克隆抗體，若抗體的特異性與適用性不足，都可能導(dǎo)致HCP漏檢，進(jìn)而給生物制品質(zhì)量安全埋下隱患。另外，ELISA檢測HCP時(shí)采用多克隆抗體，無法針對性反映高風(fēng)險(xiǎn)HCP殘留蛋白的實(shí)際存在狀況。

樣品質(zhì)量是影響宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測結(jié)果的因素之一。HCP 檢測覆蓋生物制品生產(chǎn)全流程，包含收獲、純化、制備等多個(gè)環(huán)節(jié)，不同樣品基質(zhì)會導(dǎo)致 HCP 檢測結(jié)果存在明顯差異。以含佐劑的疫苗為例，佐劑會產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致成品中難以檢測 HCP，因此通常在吸附工藝前的原液階段開展檢測。此外，樣品的收集、處理及保存方式也對檢測結(jié)果有重要影響。處理方式不當(dāng)可能造成蛋白降解或變性，進(jìn)而影響檢測結(jié)果。比如將歷史批樣品用作內(nèi)部質(zhì)控品時(shí)，需結(jié)合其穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，合理設(shè)定保存條件與保存期限，以此保障檢測方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

美國藥典 <1132> 與歐洲藥典 < 2.6.34 > 建議，對即將進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)（臨床 III 期及后續(xù)階段）或生產(chǎn)工藝已穩(wěn)定的生物制品，采用定制化 ELISA 試劑盒開展宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測，背后原因主要包括四點(diǎn)：①確保檢測方法能充分覆蓋實(shí)際工藝產(chǎn)生的 HCPs，防止漏檢關(guān)鍵雜質(zhì)；②為更準(zhǔn)確的免疫原性與安全性評估提供支持；③提供真實(shí)的工藝表征數(shù)據(jù)，而非推測性數(shù)據(jù)；④滿足商業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)量控制對方法一致性的要求。此外，研究人員對當(dāng)前市場常見的 HCP ELISA 商業(yè)化試劑盒進(jìn)行測試，并將其與 HCP ELISA 定制化試劑盒對比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同商業(yè)化試劑盒檢測同一樣品的數(shù)值差異明顯，且準(zhǔn)確性均低于定制化試劑盒 —— 這一結(jié)果表明，定制化試劑盒更能滿足產(chǎn)品質(zhì)量控制的實(shí)際需求。

依據(jù)美國藥典 1132 章節(jié)規(guī)定，HCPs 校準(zhǔn)品需具備代表性，能夠覆蓋實(shí)際產(chǎn)品生產(chǎn)工藝中的 HCPs。結(jié)合 HCP 免疫檢測方法的使用目的與預(yù)期風(fēng)險(xiǎn)管理需求，為滿足工藝開發(fā)、驗(yàn)證需求，同時(shí)應(yīng)對下游工藝可能出現(xiàn)的異常失效或工藝變更情況，建議選用上游發(fā)酵工藝末端（如澄清處理后的工藝點(diǎn)）的樣本作為 HCPs 來源。實(shí)際制備時(shí)，可采用空細(xì)胞或空載細(xì)胞，在模擬實(shí)際工藝的預(yù)設(shè)條件下采集樣本，再通過二維電泳、高分辨率質(zhì)譜等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對模擬工藝與實(shí)際工藝下 HCPs 的代表性開展表征分析。越靠近下游工藝，HCPs 的蛋白種類越少，雖更接近成品（DS）中的 HCPs，但這類樣本可能無法滿足工藝開發(fā)與驗(yàn)證需求，也難以覆蓋工藝潛在風(fēng)險(xiǎn)，因此通常不推薦使用，或只作為上游工藝 HCPs 免疫檢測方法的輔助材料。

宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測中，抗體覆蓋率評估實(shí)驗(yàn)的操作難度較高，需在實(shí)驗(yàn)方法建立階段對關(guān)鍵步驟開展充分驗(yàn)證，以確保實(shí)驗(yàn)方法具備穩(wěn)健性。湖州申科研發(fā)的磁珠捕獲式 IMBS 技術(shù)（immunomagnetic beads separation，免疫磁珠分離），在開發(fā)過程中已對關(guān)鍵步驟進(jìn)行充分驗(yàn)證，相關(guān)驗(yàn)證結(jié)果已通過專業(yè)評審，具體驗(yàn)證內(nèi)容（部分）如下：① 方法優(yōu)化：圍繞磁珠與抗體的偶聯(lián)比例、洗滌液體積、洗滌次數(shù)、洗脫次數(shù)等關(guān)鍵參數(shù)開展優(yōu)化驗(yàn)證，確保方法穩(wěn)健性；② 過程質(zhì)控：二維電泳存在實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣、時(shí)間跨度大、中間環(huán)節(jié)難把控等問題，因此在等電聚焦實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)引入熒光標(biāo)記多肽，可快速判定等電聚焦效果；同時(shí)在 SDS-PAGE 電泳兩側(cè)增設(shè) 40 ng 銀染質(zhì)控樣品，用于控制銀染顯色過程；③ 方法重復(fù)性：針對 2D 分析與 LC-MS 分析開展重復(fù)性驗(yàn)證，其中 2D 分析方法的重復(fù)性可達(dá) 80% 以上，LC-MS 分析方法的重復(fù)性可達(dá) 90% 以上；④ 上樣量優(yōu)化：針對 2D 分析與 LC-MS 分析實(shí)施上樣量驗(yàn)證，規(guī)避上樣量差異對檢測結(jié)果的影響；⑤ 假陽性排查：排查樣品與陰性抗體間是否存在非特異性結(jié)合，確認(rèn) IMBS 實(shí)驗(yàn)設(shè)定的步驟與參數(shù)是否會導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

湖州申科運(yùn)用免疫磁珠分離技術(shù)（IMBS），搭配 2D 電泳或 LC-MS 技術(shù)評估抗體覆蓋率。IMBS 的主要流程涵蓋：多克隆抗體與磁珠的偶聯(lián)反應(yīng)、磁珠未結(jié)合位點(diǎn)的封閉處理、HCP 樣本與結(jié)合抗體的磁珠共同孵育反應(yīng)。該過程中，HCP 抗體會結(jié)合可識別的 HCP，未被識別的 HCP 則通過后續(xù)洗滌步驟去除，隨后借助低 pH 等洗脫條件，收集抗體捕獲的 HCP。此方法具備 AAE（抗體親和提取，Antibody Affinity Extraction）免疫層析柱分離的全部優(yōu)勢，同時(shí)免疫磁珠可在懸浮狀態(tài)下與 HCP 樣品充分混勻并結(jié)合，HCP 結(jié)合效果更優(yōu)；且依托磁珠吸附，能減少 HCP 與填料的非特異性吸附，進(jìn)一步提升實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。