基于單核細(xì)胞系的穩(wěn)定性，MAT 熱原檢測可將復(fù)孔數(shù)從藥典要求的≥4 降至≥3。PyroSHENTEK®熱原檢測試劑盒數(shù)據(jù)顯示，單核細(xì)胞系標(biāo)曲的 4 復(fù)孔與 3 復(fù)孔，各濃度點(diǎn)（0.0125-1.0EU/mL）的準(zhǔn)確度（相對偏差）與精密度均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，無明顯差異。這一調(diào)整的主要依據(jù)是單核細(xì)胞系消除了 PBMC 的異質(zhì)性，無需依賴多復(fù)孔抵消波動，既能滿足熱原檢測的穩(wěn)定性與統(tǒng)計學(xué)合理性要求，又能減少試劑與耗材消耗，降低檢測成本，同時提升實(shí)驗效率。因此樣品預(yù)測試時可選擇3復(fù)孔進(jìn)行初步檢測，產(chǎn)品放行還需按照藥典要求進(jìn)行4復(fù)孔測試。

含消除炎癥成分的樣品可能抑制 IL-6 產(chǎn)生，需通過科學(xué)評估排除干擾，確保 MAT 法熱原檢測結(jié)果準(zhǔn)確。根據(jù)藥典要求，若樣品能抑制單核細(xì)胞促炎癥因子釋放，需通過以下步驟驗證適用性：首先，選擇樣品 A、2A、4A 倍稀釋（均不超過上限有效稀釋倍數(shù) MVD），避免高濃度消除炎癥成分過度抑制；其次，進(jìn)行供試品加標(biāo)回收率實(shí)驗，若回收率在 50%-200% 的合格范圍，說明消除炎癥成分未影響熱原檢測；再對比 “供試品配制的標(biāo)曲” 與 “稀釋液配制的標(biāo)曲”，若兩者 IL-6 檢測值相差在 ±20% 以內(nèi)，表明樣品基質(zhì)對檢測無系統(tǒng)性干擾。例如，某消除炎癥單抗樣品經(jīng) 2 倍稀釋后，加標(biāo)回收率達(dá) 120%，兩種標(biāo)曲 IL-6 值相差 15%，判定可適用 MAT 法。若出現(xiàn)回收率偏低（<50%），可嘗試增加稀釋倍數(shù)（如 8A 倍）或采用熱滅活（若樣品耐熱）去除消除炎癥活性；若仍無法排除干擾，需結(jié)合家兔法進(jìn)行對比驗證，避免因消除炎癥成分導(dǎo)致假陰性。

在單核細(xì)胞活化試驗（MAT）的熱原檢測中，IL-6 被確定為關(guān)鍵檢測指標(biāo)，而非 IL-1β 或 TNF-α，主要源于其在穩(wěn)定性、生物學(xué)關(guān)聯(lián)性及商業(yè)化應(yīng)用上的優(yōu)勢。從穩(wěn)定性來看，IL-6 在體外培養(yǎng)環(huán)境中受個體免疫狀態(tài)影響較小，半衰期更長，實(shí)驗重復(fù)性更優(yōu)，且檢測靈敏度高，能準(zhǔn)確定量熱原污染水平；而 TNF-α 和 IL-1β 產(chǎn)生時間短、表達(dá)量低，還易被蛋白酶降解，導(dǎo)致檢測信號波動大，難以標(biāo)準(zhǔn)化。從生物學(xué)特性而言，IL-6 是先天免疫反應(yīng)的炎癥介質(zhì)，可通過活化 JAK-STAT 和 NF-κB 通路驅(qū)動急性期反應(yīng)，如誘導(dǎo)大腦產(chǎn)生前列腺素 E2（PGE2）觸發(fā)發(fā)熱，與熱原的致熱機(jī)制直接關(guān)聯(lián)，是公認(rèn)的發(fā)熱標(biāo)志物。同時，MAT 法熱原檢測會輔以 IL-1β 和 TNF-α 監(jiān)測 ——IL-1β 反映單核細(xì)胞活化程度，TNF-α 提示炎癥放大效應(yīng)，形成多因子協(xié)同體系。此外，IL-6 的 ELISA 試劑盒市場成熟度高、跨平臺兼容性強(qiáng)，而 IL-1β 和 TNF-α 的檢測方法在靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)化上仍有局限，進(jìn)一步奠定了 IL-6 的重要地位。

熱原是指微量即可引發(fā)恒溫動物體溫異常升高的物質(zhì)，分為內(nèi)源性（如細(xì)胞因子）與外源性兩類，外源性熱原又涵蓋微生物來源（革蘭氏陰性菌脂多糖 LPS、革蘭氏陽性菌脂磷壁酸 LTA、病毒、真菌等）與非微生物來源（灰塵、橡膠降解產(chǎn)物等）。傳統(tǒng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（BET）只能檢測革蘭氏陰性菌的 LPS，無法覆蓋非內(nèi)毒素?zé)嵩?，而單核?xì)胞活化試驗（MAT）可彌補(bǔ)這一缺陷。其原理是：熱原通過活化單核細(xì)胞表面的 Toll 樣受體（TLR，如 TLR4 識別 LPS、TLR2/TLR6 識別 LTA），啟動先天免疫反應(yīng)，促使細(xì)胞釋放 IL-6、TNF-α 等促炎細(xì)胞因子；隨后采用 ELISA 法檢測 IL-6 濃度，結(jié)合 LPS 標(biāo)準(zhǔn)曲線推算樣品中總熱原含量，實(shí)現(xiàn)對內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩耐綑z測，契合《中國藥典》9301 指導(dǎo)原則中 全場景防控?zé)嵩L(fēng)險”的要求。

MAT 法與傳統(tǒng)家兔法在熱原檢測中，性能差異明顯，MAT 法在準(zhǔn)確性、效率與合規(guī)性上更具優(yōu)勢。從結(jié)果評判來看，MAT 法以 “加標(biāo)回收率 50%-200%、供試品濃度 < 規(guī)定限值（CLC）” 為合格標(biāo)準(zhǔn)，靈敏度達(dá) 0.0125EU/mL，可準(zhǔn)確定量熱原濃度；而家兔法只能定性（觀察體溫升高），靈敏度低（約 0.1-0.5EU/mL），易因家兔個體差異（如免疫狀態(tài)、應(yīng)激反應(yīng)）導(dǎo)致假陰性。從檢測效率來看，MAT 法樣品與細(xì)胞共培養(yǎng) 24 小時即可出結(jié)果，且可批量檢測（96 孔板一次處理多個樣品）；家兔法需連續(xù)觀察 72 小時，每次只能檢測少量樣品，耗時且人力成本高。從合規(guī)性來看，MAT 法不使用動物，符合 3R 原則，已被歐盟接受（EP 刪除家兔法）；家兔法因動物實(shí)驗屬性，面臨歐盟等地區(qū)的法規(guī)限制。此外，MAT 法重復(fù)性優(yōu)（復(fù)孔 CV 可控制在 30% 以內(nèi)），家兔法因個體差異 CV 常超 50%，進(jìn)一步凸顯 MAT 法在現(xiàn)代熱原檢測中的優(yōu)勢。

單核細(xì)胞系憑借標(biāo)準(zhǔn)化、可控性等優(yōu)勢，有效解決PBMC（外周血單個核細(xì)胞）在熱原檢測中的局限。其一，單核細(xì)胞系源自永生化細(xì)胞株（如 Mono-Mac-6），經(jīng)篩選后細(xì)胞特性高度均一，消除供體差異，讓熱原檢測結(jié)果穩(wěn)定性大幅提升。其二，其培養(yǎng)過程可控，培養(yǎng)基配方與環(huán)境（溫度、CO?濃度）可準(zhǔn)確調(diào)控，能維持細(xì)胞好的活性，避免 PBMC 因分選、凍存導(dǎo)致的活性衰減。其三，對培養(yǎng)環(huán)境波動耐受性更強(qiáng)，可保障細(xì)胞遺傳穩(wěn)定且無污染物風(fēng)險，降低熱原檢測的操作復(fù)雜度與誤差率。