MAT法熱原檢測(cè)中，獲得標(biāo)準(zhǔn) S 型標(biāo)曲需通過(guò)顯色時(shí)機(jī)控制與圖形調(diào)整實(shí)現(xiàn)，確保標(biāo)曲擬合準(zhǔn)確。在顯色時(shí)機(jī)控制上，加入 TMB 底物后，孔內(nèi)顏色會(huì)逐漸變藍(lán)，且隨反應(yīng)時(shí)間加深，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度呈現(xiàn)明顯藍(lán)色差異（如高濃度孔深藍(lán)色、低濃度孔淺藍(lán)色）時(shí)，即可加入終止液；若儀器含 600nm 波長(zhǎng)，可在終止前檢測(cè)高濃度標(biāo)準(zhǔn)品的 OD600nm 值，當(dāng)達(dá)到 1.0 左右時(shí)終止，此時(shí)顯色反應(yīng)處于線性期，終止后顏色由藍(lán)變黃，信號(hào)強(qiáng)度約增強(qiáng) 3 倍，易形成 S 型曲線。在圖形調(diào)整上，若標(biāo)曲擬合后未呈現(xiàn)明顯 S 型，可通過(guò)調(diào)整坐標(biāo)軸范圍優(yōu)化—如將縱軸（OD 值）范圍設(shè)為 0-2.5，橫軸（熱原濃度）設(shè)為對(duì)數(shù)坐標(biāo)，突出低濃度區(qū)的拐點(diǎn)與高濃度區(qū)的平臺(tái)區(qū)，使曲線更接近 S 型。此外，標(biāo)曲配制需確保濃度點(diǎn)單獨(dú)配制（非連續(xù)稀釋），避免高濃度標(biāo)準(zhǔn)品污染低濃度點(diǎn)，導(dǎo)致低濃度區(qū)信號(hào)異常升高，破壞 S 型曲線形態(tài)。通過(guò)以上方法，可有效提升 S 型標(biāo)曲的成功率，保障熱原定量的準(zhǔn)確性。

MAT 法熱原檢測(cè)中，細(xì)胞傳代的代次控制是保障檢測(cè)穩(wěn)定性的關(guān)鍵，需結(jié)合細(xì)胞特性與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)制定標(biāo)準(zhǔn)。參考行業(yè)文獻(xiàn)，單核細(xì)胞系（如 HL-60、THP1）的使用代次通常不超過(guò) 20 代，代次過(guò)高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)特性改變：一是 TLR 受體表達(dá)下降，如 TLR4 表達(dá)量在 20 代后下降 40%，導(dǎo)致內(nèi)毒素檢測(cè)靈敏度降低；二是細(xì)胞倍增時(shí)間延長(zhǎng)，從 24 小時(shí)延長(zhǎng)至 36 小時(shí)，影響共培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的準(zhǔn)確性；三是炎癥因子分泌減少，IL-6 分泌量在 20 代后下降 35%，導(dǎo)致熱原濃度低估。申科對(duì)配套的 HL-60 細(xì)胞系進(jìn)行代次穩(wěn)定性驗(yàn)證，結(jié)果顯示：1-15 代細(xì)胞的熱原響應(yīng)性一致（加標(biāo)回收率 85%-125%），16-20 代回收率波動(dòng)至 70%-130%，21 代后回收率 < 70%，因此建議控制在 1-15 代使用。實(shí)驗(yàn)室需建立細(xì)胞代次記錄制度，每傳代 1 次記錄代次，達(dá)到 15 代后及時(shí)更換新批次細(xì)胞，并驗(yàn)證新批次細(xì)胞與舊批次的一致性（如檢測(cè)同一樣品，結(jié)果偏差≤20%），確保不同代次細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定。

中國(guó)藥典與歐洲藥典對(duì) MAT 熱原檢測(cè)的細(xì)胞類型及復(fù)孔數(shù)有明確要求，且存在細(xì)節(jié)差異。細(xì)胞類型上，兩者均認(rèn)可人全血、PBMC（外周血單個(gè)核細(xì)胞，至少 4 個(gè)供體，歐洲藥典建議 8 個(gè)供體），中國(guó)藥典明確將單核細(xì)胞系納入，歐洲藥典則要求單核細(xì)胞系需做支原體污染檢測(cè)、細(xì)胞鑒別等；檢測(cè)方法均為 “熱原刺激細(xì)胞 + ELISA 檢測(cè) IL-6/IL-1β/TNF-α”。復(fù)孔數(shù)方面，兩者均規(guī)定平行孔≥4、濃度點(diǎn)≥4，中國(guó)藥典額外要求標(biāo)曲 r≥0.90，主要目的是通過(guò)多重復(fù)孔抵消 PBMC 的不穩(wěn)定性，確保熱原檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

湖州申科生物熱原檢測(cè)（MAT法） 試劑盒在靈敏度、穩(wěn)定性與適用性上表現(xiàn)突出，關(guān)鍵性能參數(shù)符合藥典要求：標(biāo)曲線性范圍 0.0125-1.0EU/mL，相關(guān)系數(shù) R2≥0.98，定量限 0.025EU/mL，檢測(cè)限（LOD）0.0125EU/mL，批間精密度 CV≤25%，可準(zhǔn)確捕捉微量熱原。其優(yōu)勢(shì)在于特定的單核細(xì)胞系 —— 與依賴供體血液的 PBMC 細(xì)胞不同，申科 MAT 細(xì)胞系來(lái)源清晰可溯源，無(wú)需倫理審批與血站合作，規(guī)避供體差異導(dǎo)致的檢測(cè)波動(dòng)。對(duì)比同類型產(chǎn)品（如國(guó)外廠家 PBMC 細(xì)胞），申科細(xì)胞系的標(biāo)曲各濃度點(diǎn) CV 更低（ 低至3.6%）、相對(duì)偏差更?。?nbsp;12.31%），線性 R2 達(dá) 1.000，穩(wěn)定性更優(yōu)。此外，細(xì)胞凍存液組分經(jīng)優(yōu)化，復(fù)蘇后活率高，無(wú)需額外調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)即可直接與供試品共孵育，操作便捷；且適配任何具備 450nm 波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀，無(wú)需專門(mén)的設(shè)備，降低實(shí)驗(yàn)室投入成本。

熱原檢測(cè)MAT法的法規(guī)地位持續(xù)提升，已成為多國(guó)藥典認(rèn)可的熱原檢測(cè)替代方法。歐洲藥典（EP）是推動(dòng) MAT 應(yīng)用的關(guān)鍵力量：通則 2.6.30 明確 MAT 可替代家兔熱原試驗(yàn)（RPT），且能同時(shí)檢測(cè)內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩?024 年歐洲藥典委員會(huì)批準(zhǔn)刪除所有條款中的家兔法，修訂文本將于 2025 年7月1日生效，強(qiáng)制鼓勵(lì)使用 MAT 等體外替代方法。美國(guó)藥典（USP）<151> 規(guī)定，經(jīng)驗(yàn)證的體外熱原試驗(yàn)（如 MAT）可替代家兔法，且需依據(jù) USP<1225>開(kāi)展驗(yàn)證；FDA 行業(yè)指南進(jìn)一步明確 MAT 的合規(guī)性。中國(guó)藥典 2020 年版通則 9301 將 MAT 列為熱原檢查的補(bǔ)充方法，雖暫未替代家兔法，但明確其適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的全熱原篩查。此外，ISO 10993-1、ICCVAM 等國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)也優(yōu)先推薦體外熱原檢測(cè)模型，全球法規(guī)協(xié)同推動(dòng) MAT 成為熱原檢測(cè)的主流技術(shù)。

MAT法熱原檢測(cè)中，樣品與細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)需嚴(yán)格控制，以保障炎癥因子分泌量穩(wěn)定。說(shuō)明書(shū)要求共培養(yǎng) 24 小時(shí)，雖未明確允差，但實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示，±30 分鐘的允差對(duì)結(jié)果無(wú)明顯影響 —— 細(xì)胞因子（如 IL-6）分泌具有時(shí)間依賴性，24 小時(shí)左右達(dá)到分泌平臺(tái)期，半小時(shí)差異不會(huì)導(dǎo)致分泌量大幅波動(dòng)。若實(shí)驗(yàn)室對(duì)結(jié)果穩(wěn)定性要求極高（如 QC 放行檢測(cè)），建議嚴(yán)格按 24 小時(shí)操作，避免因時(shí)長(zhǎng)差異引入誤差；若為預(yù)實(shí)驗(yàn)（如樣品稀釋倍數(shù)摸索），±30 分鐘允差可接受，但需在記錄中注明實(shí)際培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)。需注意的是，共培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)不可超過(guò) 26 小時(shí)或短于 22 小時(shí)：過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性下降（炎癥因子分泌減少），過(guò)短則未達(dá)分泌平臺(tái)期（檢測(cè)信號(hào)偏低），均可能導(dǎo)致熱原濃度低估。此外，培養(yǎng)環(huán)境需保持穩(wěn)定（37℃、5% CO?），溫度波動(dòng)會(huì)影響細(xì)胞代謝，間接導(dǎo)致共培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的實(shí)際效果偏離，因此需定期校準(zhǔn)培養(yǎng)箱溫度，確保環(huán)境條件一致。