北京疫苗熱原檢測單核細胞活化反應(yīng)測定法
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發(fā)布時間：2025-10-20
PyroSHENTEK®熱原檢測試劑盒（貨號 1502100，規(guī)格 96 測試 / 盒）優(yōu)勢在于搭載 MAT 特定單核細胞系，細胞表面表達多種 Toll 樣受體（TLR），可響應(yīng)不同類型熱原。該細胞系來源清晰、可溯源，均一性強且無供體依賴，有效規(guī)避了傳統(tǒng) PBMC 因供體差異導(dǎo)致的結(jié)果波動，同時安全風(fēng)險低，無需擔(dān)憂外源因子污染。試劑盒采用 “標準化單核細胞 + ELISA 檢測” 一體化體系，通過嚴格的細胞質(zhì)量控制（如凍存復(fù)融后活率達標），確保每次檢測的細胞狀態(tài)一致；搭配預(yù)包被 IL-6 抗體的酶標板與配套試劑，進一步減少體系誤差。從標曲數(shù)據(jù)來看，其擬合采用 4-Parameter Logistic 模型，R2 達 1.000，EC50 為 0.119EU/mL，參數(shù)置信區(qū)間穩(wěn)定，復(fù)孔結(jié)果重復(fù)性優(yōu)異，能為熱原定量提供準確如一的數(shù)據(jù)支撐，避免因體系不穩(wěn)定導(dǎo)致的檢測偏差。
與傳統(tǒng)方法相比，MAT 法能更覆蓋各類熱原，保障產(chǎn)品安全性。北京疫苗熱原檢測單核細胞活化反應(yīng)測定法
隨著發(fā)熱反應(yīng)分子機制研究的不斷深化，單核細胞活化試驗（MAT）作為一種體外熱原檢測技術(shù)，愈發(fā)受到醫(yī)藥與醫(yī)療器械行業(yè)的關(guān)注并逐步推廣應(yīng)用。該方法的原理是：讓人體全血與待檢樣品中的熱原充分接觸后，通過檢測體系中產(chǎn)生的 IL-1β、IL-6（因穩(wěn)定性強、重復(fù)性優(yōu)，常作為關(guān)鍵檢測指標）、TNF 等促炎細胞因子含量，實現(xiàn)對熱原污染程度的評估，整個過程能高度模擬人體先天免疫系統(tǒng)對熱原的應(yīng)答反應(yīng)。相較于傳統(tǒng)熱原檢測手段，MAT 的優(yōu)勢更為突出：不僅可檢出各類熱原污染物，包括尚未明確性質(zhì)的未知熱原，以及革蘭氏陽性菌（脂磷壁酸）、真菌、病毒等產(chǎn)生的非內(nèi)毒素?zé)嵩钛a了傳統(tǒng)內(nèi)毒素檢測（如鱟試劑法）的覆蓋空白。此外，MAT 無需使用實驗動物，契合全球 “替代、減少、優(yōu)化”（3R 原則）的監(jiān)管導(dǎo)向，目前已被《歐洲藥典》等法規(guī)列為家兔熱原試驗的替代方法，進一步提升了其在合規(guī)檢測中的適用性。
安徽熱原檢測結(jié)果判定歐洲藥典已正式廢除家兔法熱原檢測，推薦單核細胞活化反應(yīng)試驗（MAT）為合適的替代方案。
MAT法熱原檢測中，標曲信號值偏低或線性不佳是常見問題，需按細胞、標準品、ELISA 檢測三環(huán)節(jié)排查解決。細胞相關(guān)問題中，細胞復(fù)蘇后若未充分混勻?qū)е陆Y(jié)團，種板后細胞分布不均，會使局部信號弱，需振蕩細胞懸液后再種板；細胞活性差或處理時間超半小時，會降低炎癥因子分泌，需嚴格按說明書操作并縮短處理時間；孵育未達 37℃、5% CO?條件，細胞活化不足，需確保培養(yǎng)箱參數(shù)穩(wěn)定；細胞懸液若接觸外源熱原，會引發(fā)非特異性反應(yīng)，操作時需遠離熱原污染源。標準品問題方面，配制稀釋錯誤會直接導(dǎo)致濃度不準，需核對稀釋步驟；振蕩時間不足（未按說明書要求）會使內(nèi)毒素分散不均，需確保振蕩充分且 4 小時內(nèi)使用；標準品降解會導(dǎo)致效價下降，需按推薦條件保存（如 - 20℃冷凍）。ELISA 檢測環(huán)節(jié)，孵育時間短或振蕩速度慢會影響抗體結(jié)合，可適當延長孵育或提高振蕩速度；TMB 顯色不足（<3 分鐘）會導(dǎo)致信號低，需顯色 3-10 分鐘，待高濃度點 OD600 達 1.0 時加終止液。
MAT法熱原檢測中，ELISA 加終止液后的讀數(shù)時間需嚴格控制，以保障 IL-6 檢測信號穩(wěn)定。湖州申科生物MAT試劑盒說明書明確要求，終止液添加后需在 10 分鐘內(nèi)完成讀數(shù)，且需避光操作 —— 原因在于，終止液（如硫酸）會終止 TMB 顯色反應(yīng)，但生成的黃色產(chǎn)物在光照下易降解，超過 10 分鐘后 OD 值會下降，導(dǎo)致 IL-6 檢測值偏低。讀數(shù)前需進行 30 秒震蕩混勻，確保孔內(nèi)液體濃度均勻，避免因局部濃度差異導(dǎo)致復(fù)孔 OD 值波動。酶標儀波長需設(shè)置為 450nm，若儀器含 600nm 參考波長，可同時檢測 600nm 波長以扣除背景干擾（如細胞碎片導(dǎo)致的光散射），提升檢測準確性。需注意的是，讀數(shù)時不可覆蓋封板膜或蓋子，避免膜上凝結(jié)的水蒸氣滴入孔中，導(dǎo)致 OD 值異常升高。若因儀器故障無法及時讀數(shù)，需將微孔板密封后置于 4℃避光保存，并在 30 分鐘內(nèi)完成讀數(shù)，同時在記錄中注明延遲原因，評估延遲對結(jié)果的影響（如延遲 20 分鐘，OD 值可能下降 15%，需校正后使用）。
熱原具有頑強穩(wěn)定性、耐熱性（180℃/2h才能破壞）、水溶性、濾過性，可穿透常規(guī)滅菌屏障。
傳統(tǒng)熱原檢測方法的局限性十分明顯：鱟試驗法只能特異性識別細菌內(nèi)毒素，對非內(nèi)毒素?zé)嵩耆珶o響應(yīng)；家兔熱原試驗雖能篩查全類型熱原，但靈敏度低（檢測限≥5EU/kg），無法檢出微量非內(nèi)毒素?zé)嵩?，且無法區(qū)分熱原類型，難以追溯污染源頭；單核細胞活化反應(yīng)測定（MAT）的出現(xiàn)有效解決了上述難題，其關(guān)鍵優(yōu)勢在于：基于人源單核細胞的免疫應(yīng)答機制，可同時識別所有具備生物活性的熱原（包括內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素），且檢測靈敏度高（對病毒熱原檢測限低至pg級）；檢測周期短（24-48小時），可滿足產(chǎn)品快速放行需求；能通過細胞因子濃度定量評估熱原活性，避免“無活性熱原”的誤判。
熱原檢測實驗中，標準化培養(yǎng)基與恒定環(huán)境讓單核細胞系活性穩(wěn)定，避免PBMC凍存后的功能衰減。北京疫苗熱原檢測單核細胞活化反應(yīng)測定法MAT 法檢測革蘭氏陽性菌注射劑，需排查非內(nèi)毒素?zé)嵩ㄈ?LTA），避免只測內(nèi)毒素漏檢。北京疫苗熱原檢測單核細胞活化反應(yīng)測定法
PyroSHENTEK®熱原檢測試劑盒突破傳統(tǒng)檢測方法局限，不僅能檢測革蘭氏陰性菌來源的內(nèi)毒素，還可準確識別革蘭氏陽性菌（脂磷壁酸 LTA）、病毒、真菌等產(chǎn)生的非內(nèi)毒素?zé)嵩∟EP），契合熱原檢測 “全風(fēng)險覆蓋” 的法規(guī)需求。其定量限低至 0.025EU/mL，實驗數(shù)據(jù)顯示，對 Flagellin、LTA、Resiquimod、Poly-IC 等多種 NEP 均能有效檢出，且加標回收率穩(wěn)定在 50%-200% 合格范圍（如貝伐珠單抗注射液中 LTA 加標回收率 66.8%、Zysoman 加標回收率 113%）。此外，試劑盒聯(lián)合了國內(nèi)相關(guān)機構(gòu)完成室間驗證，與傳統(tǒng)家兔熱原試驗（RPT）橋接結(jié)果高度一致 —— 如人用狂犬病疫苗（Vero 細胞）中 LPS 加標回收率 152.1%、人血白蛋白中 LPS 加標回收率 71.6%，檢測數(shù)據(jù)科學(xué)性符合國際法規(guī)要求，助力企業(yè)無縫銜接中美歐等地申報標準。
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