高效熱原檢測MAT法
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發(fā)布時間：2025-10-17
單核細胞系憑借標準化、可控性等優(yōu)勢，有效解決PBMC（外周血單個核細胞）在熱原檢測中的局限。其一，單核細胞系源自永生化細胞株（如 Mono-Mac-6），經(jīng)篩選后細胞特性高度均一，消除供體差異，讓熱原檢測結(jié)果穩(wěn)定性大幅提升。其二，其培養(yǎng)過程可控，培養(yǎng)基配方與環(huán)境（溫度、CO?濃度）可準確調(diào)控，能維持細胞好的活性，避免 PBMC 因分選、凍存導(dǎo)致的活性衰減。其三，對培養(yǎng)環(huán)境波動耐受性更強，可保障細胞遺傳穩(wěn)定且無污染物風(fēng)險，降低熱原檢測的操作復(fù)雜度與誤差率。
PyroSHENTEK熱原檢測試劑盒采用“單核細胞+ELISA”標準化體系，檢測結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好，數(shù)據(jù)準確。高效熱原檢測MAT法
MAT 試劑盒配套的即用型細胞存在明確的傳代限制，且商業(yè)化傳代需獲得授權(quán)，關(guān)鍵是保障細胞質(zhì)量與檢測可靠性。首先，即用型細胞經(jīng)特殊工藝優(yōu)化，已處于較好的活性與熱原響應(yīng)狀態(tài)，不適合傳代，傳代后細胞會出現(xiàn) TLR 受體表達下降、炎癥因子分泌減少等問題，導(dǎo)致熱原檢測靈敏度降低，如 HL-60 細胞傳代超過 5 代后，IL-6 分泌量下降 30%，無法滿足檢測要求。其次，若用戶需將即用型細胞用于商業(yè)化生產(chǎn)（如大規(guī)模檢測），需獲得湖州申科授權(quán)，包括用戶資質(zhì)審核、技術(shù)培訓(xùn)、傳代方案驗證，確保用戶具備細胞培養(yǎng)與質(zhì)量控制能力，避免未經(jīng)授權(quán)傳代導(dǎo)致細胞特性改變，影響檢測結(jié)果一致性。此外，參考文獻數(shù)據(jù)，即使是可傳代的單核細胞系，使用代次也不超過 20 代，超過后代次細胞穩(wěn)定性差，因此即用型細胞設(shè)計為 “一次性使用”，從源頭避免傳代帶來的風(fēng)險。用戶需嚴格遵守傳代限制，若需長期使用，建議定期采購新批次試劑盒，確保細胞質(zhì)量。
高效熱原檢測MAT法MAT 法檢測革蘭氏陽性菌注射劑，需排查非內(nèi)毒素?zé)嵩ㄈ?LTA），避免只測內(nèi)毒素漏檢。
熱原是指微量即可引發(fā)恒溫動物體溫異常升高的物質(zhì)，分為內(nèi)源性（如細胞因子）與外源性兩類，外源性熱原又涵蓋微生物來源（革蘭氏陰性菌脂多糖 LPS、革蘭氏陽性菌脂磷壁酸 LTA、病毒、真菌等）與非微生物來源（灰塵、橡膠降解產(chǎn)物等）。傳統(tǒng)細菌內(nèi)毒素檢查法（BET）只能檢測革蘭氏陰性菌的 LPS，無法覆蓋非內(nèi)毒素?zé)嵩鴨魏思毎罨囼灒∕AT）可彌補這一缺陷。其原理是：熱原通過活化單核細胞表面的 Toll 樣受體（TLR，如 TLR4 識別 LPS、TLR2/TLR6 識別 LTA），啟動先天免疫反應(yīng)，促使細胞釋放 IL-6、TNF-α 等促炎細胞因子；隨后采用 ELISA 法檢測 IL-6 濃度，結(jié)合 LPS 標準曲線推算樣品中總熱原含量，實現(xiàn)對內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩耐綑z測，契合《中國藥典》9301 指導(dǎo)原則中 全場景防控?zé)嵩L(fēng)險”的要求。
熱原檢測技術(shù)自 20 世紀初問世以來，經(jīng)歷了 “動物試驗→體外生化檢測→細胞生物學(xué)檢測” 的三次關(guān)鍵變革，每一次變革均推動檢測效率、準確性與全面性的提升。20 世紀初至中期，熱原檢測方法只有家兔熱原試驗，通過觀察家兔體溫變化篩查熱原，雖實現(xiàn)了廣譜檢測，但存在動物成本高、操作繁瑣、靈敏度低、種屬差異大等局限，難以滿足制藥行業(yè)快速發(fā)展需求。20 世紀 60 年代，鱟試驗法（LAL 法）的發(fā)明開啟了熱原檢測的 “體外生化時代”，利用鱟血變形細胞裂解物的凝血級聯(lián)反應(yīng)檢測細菌內(nèi)毒素，靈敏度提升至 ng 級，檢測時間縮短至 1-2 小時，迅速成為制藥行業(yè)常規(guī)質(zhì)控方法；但該方法依賴鱟資源，易受 β- 葡聚糖干擾，且只能檢測內(nèi)毒素，無法覆蓋非內(nèi)毒素?zé)嵩?1 世紀以來，重組技術(shù)與細胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展推動熱原檢測進入 “全熱原管控時代”：重組級聯(lián)試劑（rCR）與重組 C 因子試劑（rFC）通過基因工程技術(shù)制備，擺脫對鱟資源的依賴，消除葡聚糖干擾，實現(xiàn)標準化生產(chǎn)；單核細胞活化反應(yīng)測定（MAT）利用人源單核細胞檢測全類型熱原，填補非內(nèi)毒素?zé)嵩瓩z測空白，且結(jié)果更貼近人體實際反應(yīng)。
與傳統(tǒng)方法相比，MAT 法能更覆蓋各類熱原，保障產(chǎn)品安全性。
含消除炎癥成分的樣品可能抑制 IL-6 產(chǎn)生，需通過科學(xué)評估排除干擾，確保 MAT 法熱原檢測結(jié)果準確。根據(jù)藥典要求，若樣品能抑制單核細胞促炎癥因子釋放，需通過以下步驟驗證適用性：首先，選擇樣品 A、2A、4A 倍稀釋（均不超過上限有效稀釋倍數(shù) MVD），避免高濃度消除炎癥成分過度抑制；其次，進行供試品加標回收率實驗，若回收率在 50%-200% 的合格范圍，說明消除炎癥成分未影響熱原檢測；再對比 “供試品配制的標曲” 與 “稀釋液配制的標曲”，若兩者 IL-6 檢測值相差在 ±20% 以內(nèi)，表明樣品基質(zhì)對檢測無系統(tǒng)性干擾。例如，某消除炎癥單抗樣品經(jīng) 2 倍稀釋后，加標回收率達 120%，兩種標曲 IL-6 值相差 15%，判定可適用 MAT 法。若出現(xiàn)回收率偏低（<50%），可嘗試增加稀釋倍數(shù)（如 8A 倍）或采用熱滅活（若樣品耐熱）去除消除炎癥活性；若仍無法排除干擾，需結(jié)合家兔法進行對比驗證，避免因消除炎癥成分導(dǎo)致假陰性。
單核細胞系傳代可控，20代以內(nèi)TLR表達與炎癥因子分泌保持穩(wěn)定，確保熱原響應(yīng)一致性。高效熱原檢測MAT法基于人體免疫機制的 MAT 熱原檢測，為熱原檢測提供了新的可靠途徑。高效熱原檢測MAT法
單核細胞活化反應(yīng)測定（MAT）是近年來熱原檢測領(lǐng)域的突破性技術(shù)，其原理基于人體免疫系統(tǒng)對熱原的天然應(yīng)答機制：人源單核細胞（如 THP-1 細胞系或新鮮人全血單核細胞）在熱原刺激下，會活化胞內(nèi)炎癥信號通路，釋放 IL-6、TNF-α 等促炎細胞因子，通過 ELISA 檢測細胞因子的濃度，即可間接反映樣品中熱原的總量與活性。與傳統(tǒng)檢測方法相比，MAT 法具備三大不可替代的優(yōu)勢：一是廣譜性，可同時檢測細菌內(nèi)毒素、病毒、真菌毒素、支原體等所有類型熱原，填補了鱟試驗法只能檢測內(nèi)毒素的 “非內(nèi)毒素?zé)嵩^(qū)”，尤其適用于疫苗、基因治療產(chǎn)品等易受多種熱原污染的高風(fēng)險產(chǎn)品；二是人源相關(guān)性，采用與人體同源的細胞模型，檢測結(jié)果更貼近臨床實際熱原反應(yīng)，避免家兔試驗中動物種屬差異導(dǎo)致的誤判；三是高靈敏度，對細菌內(nèi)毒素的檢測限可達 0.0125EU/mL，對非內(nèi)毒素?zé)嵩ㄈ缃湍付嗵恰⑾俨《荆┑臋z測限低至 ng/pg 級，滿足低限值產(chǎn)品的質(zhì)控需求。
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