MAT 法熱原檢測(cè)中，細(xì)胞傳代的代次控制是保障檢測(cè)穩(wěn)定性的關(guān)鍵，需結(jié)合細(xì)胞特性與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)制定標(biāo)準(zhǔn)。參考行業(yè)文獻(xiàn)，單核細(xì)胞系（如 HL-60、THP1）的使用代次通常不超過 20 代，代次過高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)特性改變：一是 TLR 受體表達(dá)下降，如 TLR4 表達(dá)量在 20 代后下降 40%，導(dǎo)致內(nèi)毒素檢測(cè)靈敏度降低；二是細(xì)胞倍增時(shí)間延長(zhǎng)，從 24 小時(shí)延長(zhǎng)至 36 小時(shí)，影響共培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的準(zhǔn)確性；三是炎癥因子分泌減少，IL-6 分泌量在 20 代后下降 35%，導(dǎo)致熱原濃度低估。申科對(duì)配套的 HL-60 細(xì)胞系進(jìn)行代次穩(wěn)定性驗(yàn)證，結(jié)果顯示：1-15 代細(xì)胞的熱原響應(yīng)性一致（加標(biāo)回收率 85%-125%），16-20 代回收率波動(dòng)至 70%-130%，21 代后回收率 < 70%，因此建議控制在 1-15 代使用。實(shí)驗(yàn)室需建立細(xì)胞代次記錄制度，每傳代 1 次記錄代次，達(dá)到 15 代后及時(shí)更換新批次細(xì)胞，并驗(yàn)證新批次細(xì)胞與舊批次的一致性（如檢測(cè)同一樣品，結(jié)果偏差≤20%），確保不同代次細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定。

MAT法熱原檢測(cè)中，ELISA 加終止液后的讀數(shù)時(shí)間需嚴(yán)格控制，以保障 IL-6 檢測(cè)信號(hào)穩(wěn)定。湖州申科生物MAT試劑盒說明書明確要求，終止液添加后需在 10 分鐘內(nèi)完成讀數(shù)，且需避光操作 —— 原因在于，終止液（如硫酸）會(huì)終止 TMB 顯色反應(yīng)，但生成的黃色產(chǎn)物在光照下易降解，超過 10 分鐘后 OD 值會(huì)下降，導(dǎo)致 IL-6 檢測(cè)值偏低。讀數(shù)前需進(jìn)行 30 秒震蕩混勻，確?？變?nèi)液體濃度均勻，避免因局部濃度差異導(dǎo)致復(fù)孔 OD 值波動(dòng)。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)需設(shè)置為 450nm，若儀器含 600nm 參考波長(zhǎng)，可同時(shí)檢測(cè) 600nm 波長(zhǎng)以扣除背景干擾（如細(xì)胞碎片導(dǎo)致的光散射），提升檢測(cè)準(zhǔn)確性。需注意的是，讀數(shù)時(shí)不可覆蓋封板膜或蓋子，避免膜上凝結(jié)的水蒸氣滴入孔中，導(dǎo)致 OD 值異常升高。若因儀器故障無法及時(shí)讀數(shù)，需將微孔板密封后置于 4℃避光保存，并在 30 分鐘內(nèi)完成讀數(shù)，同時(shí)在記錄中注明延遲原因，評(píng)估延遲對(duì)結(jié)果的影響（如延遲 20 分鐘，OD 值可能下降 15%，需校正后使用）。

一次合格的 MAT 法熱原檢測(cè)，需同時(shí)滿足 “合格標(biāo)曲” 與 “合格樣品檢測(cè)值及回收率” 兩大關(guān)鍵條件。合格標(biāo)曲需具備四要素：一是良好線性，采用 4-Parameter Logistic 擬合，R2 需接近 1.0，避免線性不佳導(dǎo)致定量偏差；二是良好信號(hào)值，各濃度點(diǎn) OD 值需呈梯度變化，高濃度點(diǎn) OD 值需足夠（如上限濃度 OD600 達(dá) 1.0 左右），信號(hào)過低會(huì)影響靈敏度；三是良好 CV，復(fù)孔間 CV 需控制在合理范圍（定量限內(nèi)≤25%、定量上下限≤30%），確保重復(fù)性；四是良好背景值，陰性對(duì)照 OD 值需低于標(biāo)曲下限濃度點(diǎn) 10%，排除外源污染。合格樣品檢測(cè)值則需滿足加標(biāo)回收率在 50%-200%，例如文檔中某樣品 10 倍稀釋回收率 41.3%（不合格），20 倍 71.3%（接近合格），40 倍 97.7%（合格），需在 MVD 范圍內(nèi)調(diào)整稀釋倍數(shù)，同時(shí)樣品熱原濃度需低于規(guī)定限值（CLC），方可判定樣品符合要求。

MAT法熱原檢測(cè)中，獲得標(biāo)準(zhǔn) S 型標(biāo)曲需通過顯色時(shí)機(jī)控制與圖形調(diào)整實(shí)現(xiàn)，確保標(biāo)曲擬合準(zhǔn)確。在顯色時(shí)機(jī)控制上，加入 TMB 底物后，孔內(nèi)顏色會(huì)逐漸變藍(lán)，且隨反應(yīng)時(shí)間加深，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度呈現(xiàn)明顯藍(lán)色差異（如高濃度孔深藍(lán)色、低濃度孔淺藍(lán)色）時(shí)，即可加入終止液；若儀器含 600nm 波長(zhǎng)，可在終止前檢測(cè)高濃度標(biāo)準(zhǔn)品的 OD600nm 值，當(dāng)達(dá)到 1.0 左右時(shí)終止，此時(shí)顯色反應(yīng)處于線性期，終止后顏色由藍(lán)變黃，信號(hào)強(qiáng)度約增強(qiáng) 3 倍，易形成 S 型曲線。在圖形調(diào)整上，若標(biāo)曲擬合后未呈現(xiàn)明顯 S 型，可通過調(diào)整坐標(biāo)軸范圍優(yōu)化—如將縱軸（OD 值）范圍設(shè)為 0-2.5，橫軸（熱原濃度）設(shè)為對(duì)數(shù)坐標(biāo)，突出低濃度區(qū)的拐點(diǎn)與高濃度區(qū)的平臺(tái)區(qū)，使曲線更接近 S 型。此外，標(biāo)曲配制需確保濃度點(diǎn)單獨(dú)配制（非連續(xù)稀釋），避免高濃度標(biāo)準(zhǔn)品污染低濃度點(diǎn)，導(dǎo)致低濃度區(qū)信號(hào)異常升高，破壞 S 型曲線形態(tài)。通過以上方法，可有效提升 S 型標(biāo)曲的成功率，保障熱原定量的準(zhǔn)確性。

MAT法熱原檢測(cè)特定標(biāo)準(zhǔn)品與傳統(tǒng)細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品存在本質(zhì)差異，需明確區(qū)分以保障檢測(cè)準(zhǔn)確性。MAT 特定標(biāo)準(zhǔn)品為大腸桿菌（E.coli 0113:H10:K）菌株制備，經(jīng)全國(guó) 5 家藥品檢驗(yàn)所（含中檢院）用凝膠法、動(dòng)態(tài)濁度法及動(dòng)態(tài)顯色法協(xié)作標(biāo)定，溯源至國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，可同時(shí)檢測(cè)內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩?；而傳統(tǒng)細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（如 9000EU 規(guī)格）源自大腸桿菌（E.coli O111:B4），只適用于內(nèi)毒素檢測(cè)，無法識(shí)別非內(nèi)毒素?zé)嵩ｊP(guān)鍵驗(yàn)證數(shù)據(jù)顯示，用 MAT法檢測(cè) 9000EU 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，加標(biāo)回收率不在 50%-200% 的合格范圍，因此不能替代 MAT 特定標(biāo)準(zhǔn)品。值得注意的是，盡管 MAT 試劑盒用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)曲，但經(jīng)驗(yàn)證其可識(shí)別非內(nèi)毒素?zé)嵩魳悠分写嬖诜莾?nèi)毒素?zé)嵩ㄈ绺锾m氏陽性菌的脂磷壁酸），會(huì)觸發(fā)細(xì)胞陽性反應(yīng)，有效避免漏檢，這也是 MAT 法在熱原防控中優(yōu)于單一內(nèi)毒素檢測(cè)的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)。

革蘭氏陽性菌注射劑產(chǎn)品只依賴內(nèi)毒素檢測(cè)存在安全風(fēng)險(xiǎn)，需結(jié)合熱原檢測(cè)特性制定防控方案。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖成分，而革蘭氏陽性菌可產(chǎn)生非內(nèi)毒素?zé)嵩∟EPs），如脂磷壁酸，這類物質(zhì)同樣能引發(fā)人體發(fā)熱反應(yīng)，若只檢測(cè)內(nèi)毒素，可能遺漏 NEPs 污染，導(dǎo)致臨床用藥風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)此，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估需重點(diǎn)關(guān)注三點(diǎn)：一是建議開展家兔法與內(nèi)毒素檢測(cè)的一致性實(shí)驗(yàn)，對(duì)比兩種方法的檢測(cè)結(jié)果，排查是否存在內(nèi)毒素未檢出但家兔法陽性的情況；二是采用 MAT 法熱原檢測(cè)，其通過單核細(xì)胞活化機(jī)制，可同時(shí)識(shí)別內(nèi)毒素與 NEPs，若 MAT 法檢測(cè)陽性，需進(jìn)一步追溯 NEPs 來源；三是若無法排除 NEPs 風(fēng)險(xiǎn)，必須按藥典要求補(bǔ)充熱原檢測(cè)（如 MAT 法或家兔法），而非只依賴內(nèi)毒素檢測(cè)。尤其對(duì)于新藥或工藝變更后的產(chǎn)品，需通過多方法驗(yàn)證，確保熱原檢測(cè)覆蓋所有潛在致熱物質(zhì)，保障臨床用藥安全。