熱原檢測技術(shù)自 20 世紀初問世以來，經(jīng)歷了 “動物試驗→體外生化檢測→細胞生物學(xué)檢測” 的三次關(guān)鍵變革，每一次變革均推動檢測效率、準確性與全面性的提升。20 世紀初至中期，熱原檢測方法只有家兔熱原試驗，通過觀察家兔體溫變化篩查熱原，雖實現(xiàn)了廣譜檢測，但存在動物成本高、操作繁瑣、靈敏度低、種屬差異大等局限，難以滿足制藥行業(yè)快速發(fā)展需求。20 世紀 60 年代，鱟試驗法（LAL 法）的發(fā)明開啟了熱原檢測的 “體外生化時代”，利用鱟血變形細胞裂解物的凝血級聯(lián)反應(yīng)檢測細菌內(nèi)毒素，靈敏度提升至 ng 級，檢測時間縮短至 1-2 小時，迅速成為制藥行業(yè)常規(guī)質(zhì)控方法；但該方法依賴鱟資源，易受 β- 葡聚糖干擾，且只能檢測內(nèi)毒素，無法覆蓋非內(nèi)毒素?zé)嵩?1 世紀以來，重組技術(shù)與細胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展推動熱原檢測進入 “全熱原管控時代”：重組級聯(lián)試劑（rCR）與重組 C 因子試劑（rFC）通過基因工程技術(shù)制備，擺脫對鱟資源的依賴，消除葡聚糖干擾，實現(xiàn)標(biāo)準化生產(chǎn)；單核細胞活化反應(yīng)測定（MAT）利用人源單核細胞檢測全類型熱原，填補非內(nèi)毒素?zé)嵩瓩z測空白，且結(jié)果更貼近人體實際反應(yīng)。

熱原是指微量即可引發(fā)恒溫動物體溫異常升高的物質(zhì)，分為內(nèi)源性（如細胞因子）與外源性兩類，外源性熱原又涵蓋微生物來源（革蘭氏陰性菌脂多糖 LPS、革蘭氏陽性菌脂磷壁酸 LTA、病毒、真菌等）與非微生物來源（灰塵、橡膠降解產(chǎn)物等）。傳統(tǒng)細菌內(nèi)毒素檢查法（BET）只能檢測革蘭氏陰性菌的 LPS，無法覆蓋非內(nèi)毒素?zé)嵩鴨魏思毎罨囼灒∕AT）可彌補這一缺陷。其原理是：熱原通過活化單核細胞表面的 Toll 樣受體（TLR，如 TLR4 識別 LPS、TLR2/TLR6 識別 LTA），啟動先天免疫反應(yīng)，促使細胞釋放 IL-6、TNF-α 等促炎細胞因子；隨后采用 ELISA 法檢測 IL-6 濃度，結(jié)合 LPS 標(biāo)準曲線推算樣品中總熱原含量，實現(xiàn)對內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩耐綑z測，契合《中國藥典》9301 指導(dǎo)原則中 全場景防控?zé)嵩L(fēng)險”的要求。

MAT法熱原檢測出現(xiàn) “無信號”，需從試劑、實驗操作、儀器三方面定位原因并解決。試劑層面，抗體不足或失活會導(dǎo)致無法捕獲 IL-6，需核對抗體稀釋比例，檢查保存條件（如 2-8℃）與有效期，必要時更換試劑；底物失效（如變色、沉淀）會無法顯色，需觀察底物外觀，失效則更換；混合不同試劑盒試劑會因成分不匹配導(dǎo)致反應(yīng)失敗，需使用同試劑盒試劑；ELISA 試劑盒保存不當(dāng)（如反復(fù)凍融）會破壞試劑活性，需按說明書分條件保存（如抗體 2-8℃、底物避光）。實驗操作中，孵育溫度過低（<37℃）會抑制酶促反應(yīng)，需提前將試劑與孔板平衡至室溫，確保孵育溫度達標(biāo)；洗板機壓力過高或手動洗滌過猛，會洗去結(jié)合的抗體與酶，需調(diào)整洗板機壓力或輕柔手動洗滌；孵育時孔板未密封導(dǎo)致孔變干，會使反應(yīng)體系破壞，需用封口膜密封孔板。儀器方面，洗板機噴頭堵塞會導(dǎo)致洗滌不均或未洗，需清理噴頭；酶標(biāo)儀波長設(shè)置錯誤（未選 450nm）會無法檢測信號，需確認波長設(shè)置正確。

PyroSHENTEK^®熱原檢測試劑盒依據(jù) ICH Q2 (R2)、《中國藥典》（如通則 9301）及歐洲藥典（EP 2.6.30）要求，完成了線性、范圍、定量限、準確度、精密度、耐用性等全維度性能驗證。線性方面，0.0125-1.0EU/mL范圍內(nèi)擬合良好，R2≥0.98；準確度通過加標(biāo)回收實驗驗證，不同樣品基質(zhì)（如生物制品、化學(xué)制藥原料）的回收率均落在 50%-200% 區(qū)間；精密度表現(xiàn)優(yōu)異，批內(nèi)與批間 CV 均≤15%，且無論是 3 復(fù)孔還是 4 復(fù)孔檢測均能達標(biāo)。此外，試劑盒使用中國藥典推薦的 MAT 特定標(biāo)準品，可直接用于國內(nèi)外申報，契合全球 “3R 原則” 監(jiān)管導(dǎo)向—尤其適配《歐洲藥典》刪除家兔法、《美國藥典》鼓勵 MAT 替代等新法規(guī)趨勢，為企業(yè)應(yīng)對不同地區(qū)的熱原檢測合規(guī)要求提供有力支持。

MAT法熱原檢測中，ELISA 加終止液后的讀數(shù)時間需嚴格控制，以保障 IL-6 檢測信號穩(wěn)定。湖州申科生物MAT試劑盒說明書明確要求，終止液添加后需在 10 分鐘內(nèi)完成讀數(shù)，且需避光操作 —— 原因在于，終止液（如硫酸）會終止 TMB 顯色反應(yīng)，但生成的黃色產(chǎn)物在光照下易降解，超過 10 分鐘后 OD 值會下降，導(dǎo)致 IL-6 檢測值偏低。讀數(shù)前需進行 30 秒震蕩混勻，確?？變?nèi)液體濃度均勻，避免因局部濃度差異導(dǎo)致復(fù)孔 OD 值波動。酶標(biāo)儀波長需設(shè)置為 450nm，若儀器含 600nm 參考波長，可同時檢測 600nm 波長以扣除背景干擾（如細胞碎片導(dǎo)致的光散射），提升檢測準確性。需注意的是，讀數(shù)時不可覆蓋封板膜或蓋子，避免膜上凝結(jié)的水蒸氣滴入孔中，導(dǎo)致 OD 值異常升高。若因儀器故障無法及時讀數(shù)，需將微孔板密封后置于 4℃避光保存，并在 30 分鐘內(nèi)完成讀數(shù)，同時在記錄中注明延遲原因，評估延遲對結(jié)果的影響（如延遲 20 分鐘，OD 值可能下降 15%，需校正后使用）。

生物制品（如單克隆抗體、重組蛋白、細胞因子）因基質(zhì)成分復(fù)雜（含高濃度蛋白質(zhì)、螯合劑、表面活性劑、緩沖鹽等），在熱原檢測過程中易出現(xiàn)“反應(yīng)抑制”或“非特異性增強”現(xiàn)象，嚴重影響檢測結(jié)果準確性。選擇抗干擾能力更強的檢測方法至關(guān)重要，重組級聯(lián)試劑（rCR）因采用完整級聯(lián)反應(yīng)路徑，抗干擾性優(yōu)于天然 LAL；單核細胞活化反應(yīng)測定（MAT）對復(fù)雜基質(zhì)耐受性更高，通過適當(dāng)稀釋即可消除多數(shù)干擾，因此生物制品熱原檢測常采用 “rCR 法（內(nèi)毒素定量）+ MAT 法（全熱原篩查）” 的聯(lián)合方案，既保證內(nèi)毒素檢測的準確性，又防控非內(nèi)毒素?zé)嵩L(fēng)險。