如胰腺，一般取胰島較多的胰腺尾部；肺應(yīng)取有細(xì)支氣管及帶有軟骨片的小支氣管部。如果實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行多樣本的采集，采集順序應(yīng)按照：消化，神經(jīng)系統(tǒng)，皮膚，肌肉等的順序進(jìn)行。選好塊的切面。熟悉某些成分安排，然后決定其切面的走向；如一長(zhǎng)管狀以橫切面較好。切除不需要的部分。特別是周?chē)闹镜龋瑧?yīng)盡可能掉，否則給固定、脫水、浸蠟、切片等帶來(lái)一些不必要的問(wèn)題。樣品的固定（1）固定的方法：①小塊固定法：從動(dòng)物取下的小塊，立即置入液態(tài)固定劑（這是應(yīng)用經(jīng)常的方法）。②注射/灌注固定法：某些塊由于體積過(guò)大或固定液極難滲入內(nèi)部或需要對(duì)整個(gè)臟器或整個(gè)動(dòng)物進(jìn)行固定，這時(shí)宜采用注射固定法，將固定液注入血管，經(jīng)血管分支到達(dá)整個(gè)和全身，從而得到充分的固定。另，空腔比如肺，肺內(nèi)含有空氣，固定液難以滲入，建議先做肺灌注，使得肺充盈滿固定液以后再進(jìn)行保存，如果空腔中氣體沒(méi)有排出，后續(xù)可能影響固定效果（沒(méi)有灌注的肺會(huì)浮在液體表面不利于固定，切片以后也會(huì)看到很多的空泡）。③蒸汽固定法：比較細(xì)小而薄的標(biāo)本，可用鋨酸或甲醛蒸汽固定。主要用于血液或細(xì)胞涂片以及某些薄膜的固定。。健康的HEK 293T細(xì)胞，一般使用復(fù)蘇后10代以內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的生產(chǎn)，要求無(wú)菌以及支原體污染；浙江小鼠科研技術(shù)服務(wù)外包

把膜先用TBST泡洗兩遍再用5%脫脂奶粉或者BSA室溫封閉1-2小時(shí)。注意一定要讓蛋白面充分接觸封閉液。2、孵一抗脫脂奶粉封閉的話，要用TBST泡洗三遍再轉(zhuǎn)移至一抗溶液中，BSA封閉的可以直接轉(zhuǎn)移至一抗中。如果膜的寬(膜是一個(gè)長(zhǎng)方形，這里的寬與長(zhǎng)相對(duì)應(yīng))不大于8毫米，我習(xí)慣置于15毫升離心管中孵育，兩條膜"背對(duì)背"式放置于一個(gè)管子里(3毫升液體即可)。如果大于8毫米，就用普通的5格的一抗孵育盒(4毫升即可)。4度過(guò)夜，一般是12-18個(gè)小時(shí)，注意放置水平，用搖床。內(nèi)參等蛋白豐度很高的如果孵久了可能出現(xiàn)條帶連在一起的情況，這時(shí)可以縮短孵育時(shí)間或者降低一抗的濃度。六、孵二抗顯影1、孵二抗室溫一個(gè)小時(shí)足矣。這步要注意的是建議用5%BSA或者脫脂奶粉稀釋二抗，這樣背景會(huì)干凈許多。也要注意膜的蛋白面要充分接觸二抗溶液，我們一般一條膜一個(gè)槽地孵。2、顯影這一步有個(gè)細(xì)節(jié)可能有些同學(xué)沒(méi)注意到，就是ECL發(fā)光液要與HRP反應(yīng)一分鐘后顯影效果才會(huì)更好，還有要注意的是顯影液要均勻覆蓋，一般第二次顯影(加新的顯影液)比一次好看。貴州兔科研技術(shù)服務(wù)技術(shù)常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型按產(chǎn)生原因分為以下5類(lèi)：自發(fā)性動(dòng)物模型、誘發(fā)型模型、遺傳工程模型、醫(yī)學(xué)模型陰性模型。

首先，預(yù)實(shí)驗(yàn)必須要當(dāng)做正式實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)待（態(tài)度要放端正，這是必須的）。預(yù)實(shí)驗(yàn)的每一步都需要詳細(xì)規(guī)劃，多方籌謀。不論是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇，還是檢測(cè)試劑的購(gòu)買(mǎi)，都盡量和正式實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。建議大家先把所有試劑和購(gòu)買(mǎi)完畢后，再去購(gòu)買(mǎi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。因?yàn)閯?dòng)物會(huì)長(zhǎng)胖，長(zhǎng)胖后給劑量就要增加，不僅多花錢(qián)，并且還容易影響實(shí)驗(yàn)效果。筆者曾經(jīng)提前將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物買(mǎi)回，但因?yàn)樘厥庠驔](méi)能購(gòu)買(mǎi)到造模，終只能忍痛割?lèi)?ài)將動(dòng)物贈(zèng)送他人，白白虧了一筆血汗錢(qián)（那批老鼠在我這兒白吃白喝長(zhǎng)得太胖，沒(méi)辦法用作造模）。動(dòng)物及試劑購(gòu)買(mǎi)首先需要考慮：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品種、體重、性別、周齡（通常根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道可以獲得答案）、數(shù)量（需要考慮到實(shí)驗(yàn)有一定動(dòng)物死亡率或者動(dòng)物本身會(huì)打架互毆，因此需要提前購(gòu)買(mǎi)足夠的動(dòng)物）。動(dòng)物購(gòu)買(mǎi)的途徑、安置的地點(diǎn)，飲食管理（一般實(shí)驗(yàn)室會(huì)有動(dòng)物房，也可以從其他地方購(gòu)買(mǎi)），動(dòng)物免證明、倫理證明需要提前準(zhǔn)備好。實(shí)驗(yàn)相關(guān)的試劑和：比如造模和，動(dòng)物干預(yù)所需，陽(yáng)性選擇及購(gòu)買(mǎi)（有些購(gòu)買(mǎi)很困難，必須通過(guò)特殊程序才能買(mǎi)到）。如果涉及到有創(chuàng)操作，要提前準(zhǔn)備好（建議提前購(gòu)買(mǎi)），手術(shù)。需要了解自身實(shí)驗(yàn)平臺(tái)能完成哪些技術(shù)。

如果實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的儀器需要提前預(yù)約，建議提前規(guī)劃好使用的時(shí)間。反復(fù)總結(jié)尋找答案在整個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)很多問(wèn)題。比如造模效果欠佳、灌胃操作不當(dāng)、腹腔注射操作失誤、使用不當(dāng)?shù)纫饎?dòng)物死亡。每遇到問(wèn)題都需要自己想辦法解決，可以從導(dǎo)師、師兄師姐、文獻(xiàn)、貼吧、視頻教程等找到答案。比如筆者曾遇到同樣的給，發(fā)現(xiàn)有的大鼠得很深，有的大鼠還活蹦亂跳，在反復(fù)嘗試調(diào)整濃度，給劑量，更換方式，后來(lái)才發(fā)現(xiàn)是動(dòng)物體重秤的準(zhǔn)度有問(wèn)題，導(dǎo)致體重秤得不準(zhǔn)。因此，需要自己反復(fù)琢磨到底是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中哪一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題，逐一排除。也要求在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟需要標(biāo)準(zhǔn)化，統(tǒng)一化，盡可能的排除干擾因素，這樣方便在遇到問(wèn)題快的找到答案。同時(shí)，建議每日總結(jié)，大到動(dòng)物死亡原因分析，小到灌胃操作耗時(shí)多長(zhǎng)時(shí)間。建議反復(fù)總結(jié)出每天實(shí)驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn)。做任何一個(gè)操作之前，建議提前腦海中反復(fù)模擬，準(zhǔn)備好相關(guān)工具和試劑，避免臨用之際缺少的，影響實(shí)驗(yàn)操作節(jié)奏和個(gè)人心情。筆者曾經(jīng)灌胃操作的時(shí)候發(fā)現(xiàn)竟然忘帶了，只好重新回實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備，那真叫一個(gè)郁悶。仔細(xì)記錄每日實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)論是碩士還是博士，導(dǎo)師給我們上的堂課往往就是交代我們要詳細(xì)記好實(shí)驗(yàn)記錄，只要是和實(shí)驗(yàn)相關(guān)的?？蒲行“兹绾蚊髯约旱念A(yù)實(shí)驗(yàn)。

建議按照2×106每孔的數(shù)量將293T細(xì)胞均勻鋪入。(2)第二天：在24小時(shí)之內(nèi)，觀察293T細(xì)胞的匯合度在90%~95%之間時(shí)，向其中加入DNA-脂質(zhì)體復(fù)合體，DNA-脂質(zhì)體復(fù)合體制備方法如下：a)輕輕混勻LipoMax，根據(jù)說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)量于500μlOpti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基中，混合均勻并置于室溫5分鐘。b)在500μlOpti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基中稀釋DNA，總質(zhì)量為15μg按照載體質(zhì)粒:psPAX2:=4:3:1的比例加入DNA。c)將稀釋后的LipoMax和稀釋后的DNA輕輕混勻，常溫靜置20分鐘，形成DNA-LipoMax復(fù)合體。(3)將DNA-LipoMax復(fù)合體輕柔地滴加至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖晃培養(yǎng)皿混勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(4)病毒收集濃縮病毒：加入DNA-LipoMax復(fù)合體48小時(shí)后，收集病毒上清，同時(shí)加入10ml預(yù)溫的293T培養(yǎng)基到細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將收集到的病毒上清存在4℃冰箱中;收集72小時(shí)病毒上清，與48小時(shí)病毒上清混在一起。將離心機(jī)溫度降溫到4℃，600g，離心5分鐘，去除其中的細(xì)胞碎片，上清液經(jīng)μm濾頭過(guò)濾，加入病毒濃縮液，配制濃縮病毒液。將濃縮后的病毒放于4℃冰箱搖床上，旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。第二天，4度離心機(jī)，3000~4000g離心15分鐘。棄掉上清液，加入1Xpbs或培養(yǎng)基重懸。純干貨Western blot （WB）條帶灰度統(tǒng)計(jì)與GraphPad作圖.湖南血液科研技術(shù)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室

細(xì)胞生物學(xué)是生物學(xué)的一個(gè)分支，研究細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能、生理和遺傳學(xué)等方面。浙江小鼠科研技術(shù)服務(wù)外包

是整體甲基化進(jìn)程所必須的[2]。FTO是ALKB家族的成員，作為個(gè)被發(fā)現(xiàn)的去甲基酶，可影響剪切因子SRSF2的RNA結(jié)合能力，進(jìn)而調(diào)控pre-mRNA的剪切加工過(guò)程[3]。目前已發(fā)現(xiàn)FTO調(diào)節(jié)異常與肥胖、大腦畸形和生長(zhǎng)遲緩相關(guān)，揭示m6A可能對(duì)這些疾病具有重要的調(diào)節(jié)功能[4-6]。ALKBH5是ALKB家族中被發(fā)現(xiàn)具有去甲基作用的另一個(gè)成員，以RNaseA敏感的方式與核小斑共定位，它可直接催化m6A-甲基化腺苷去除甲基而不同于FTO的氧化去甲基化[7].此外，ALKBH5和它的去甲基化活性影響新生mRNA合的成和剪切效率[7]，且ALKBH5敲除雄性小鼠表現(xiàn)出精子發(fā)生異常，這可能是精子發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)改變的結(jié)果[7]。m6AmRNA修飾執(zhí)行其功能主要通過(guò)兩個(gè)途徑：精細(xì)調(diào)控甲基化轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)，以阻止或誘使蛋白-RNA相互作用；或被直接由m6A結(jié)合蛋白識(shí)別，誘發(fā)續(xù)反應(yīng)。目前一類(lèi)含有YTH功能結(jié)構(gòu)域的蛋白被鑒定為m6A修飾的結(jié)合蛋白。其中YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3，YTHDC1和YTHDC2己被證實(shí)是ｍ６Ａ的結(jié)合蛋白.YTHDF1主要影響ｍ６Ａ修飾基因的翻譯，YTHDF2主要影響ｍ６Ａ修飾基因的降解，而YTHDC1結(jié)合ｍ６Ａ修飾的基因影響其剪接。HNRNPC是一種豐富的核RNA結(jié)合蛋白，參與pre-mRNA的加工[8]。浙江小鼠科研技術(shù)服務(wù)外包