熱原檢測(cè)MAT法的法規(guī)地位持續(xù)提升，已成為多國(guó)藥典認(rèn)可的熱原檢測(cè)替代方法。歐洲藥典（EP）是推動(dòng) MAT 應(yīng)用的關(guān)鍵力量：通則 2.6.30 明確 MAT 可替代家兔熱原試驗(yàn)（RPT），且能同時(shí)檢測(cè)內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩?024 年歐洲藥典委員會(huì)批準(zhǔn)刪除所有條款中的家兔法，修訂文本將于 2025 年7月1日生效，強(qiáng)制鼓勵(lì)使用 MAT 等體外替代方法。美國(guó)藥典（USP）<151> 規(guī)定，經(jīng)驗(yàn)證的體外熱原試驗(yàn)（如 MAT）可替代家兔法，且需依據(jù) USP<1225>開展驗(yàn)證；FDA 行業(yè)指南進(jìn)一步明確 MAT 的合規(guī)性。中國(guó)藥典 2020 年版通則 9301 將 MAT 列為熱原檢查的補(bǔ)充方法，雖暫未替代家兔法，但明確其適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的全熱原篩查。此外，ISO 10993-1、ICCVAM 等國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)也優(yōu)先推薦體外熱原檢測(cè)模型，全球法規(guī)協(xié)同推動(dòng) MAT 成為熱原檢測(cè)的主流技術(shù)。

在單核細(xì)胞活化試驗(yàn)（MAT）的熱原檢測(cè)中，IL-6 被確定為關(guān)鍵檢測(cè)指標(biāo)，而非 IL-1β 或 TNF-α，主要源于其在穩(wěn)定性、生物學(xué)關(guān)聯(lián)性及商業(yè)化應(yīng)用上的優(yōu)勢(shì)。從穩(wěn)定性來看，IL-6 在體外培養(yǎng)環(huán)境中受個(gè)體免疫狀態(tài)影響較小，半衰期更長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性更優(yōu)，且檢測(cè)靈敏度高，能準(zhǔn)確定量熱原污染水平；而 TNF-α 和 IL-1β 產(chǎn)生時(shí)間短、表達(dá)量低，還易被蛋白酶降解，導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)波動(dòng)大，難以標(biāo)準(zhǔn)化。從生物學(xué)特性而言，IL-6 是先天免疫反應(yīng)的炎癥介質(zhì)，可通過活化 JAK-STAT 和 NF-κB 通路驅(qū)動(dòng)急性期反應(yīng)，如誘導(dǎo)大腦產(chǎn)生前列腺素 E2（PGE2）觸發(fā)發(fā)熱，與熱原的致熱機(jī)制直接關(guān)聯(lián)，是公認(rèn)的發(fā)熱標(biāo)志物。同時(shí)，MAT 法熱原檢測(cè)會(huì)輔以 IL-1β 和 TNF-α 監(jiān)測(cè) ——IL-1β 反映單核細(xì)胞活化程度，TNF-α 提示炎癥放大效應(yīng)，形成多因子協(xié)同體系。此外，IL-6 的 ELISA 試劑盒市場(chǎng)成熟度高、跨平臺(tái)兼容性強(qiáng)，而 IL-1β 和 TNF-α 的檢測(cè)方法在靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)化上仍有局限，進(jìn)一步奠定了 IL-6 的重要地位。

傳統(tǒng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（BET）只能檢測(cè)革蘭氏陰性菌的 LPS，無法識(shí)別革蘭氏陽性菌 LTA、真菌酵母多糖、病毒鞭毛蛋白等非內(nèi)毒素?zé)嵩?，存在漏檢風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，部分樣品（如脂質(zhì)體、表面活性劑制劑）會(huì)因內(nèi)毒素吸附導(dǎo)致低內(nèi)毒素回收（LER），BET法難以準(zhǔn)確定量。MAT 法通過單核細(xì)胞表面的多種 TLR 受體（TLR1-TLR10），可識(shí)別不同類型熱原：TLR4 識(shí)別 LPS、TLR2/TLR6 識(shí)別 LTA 與酵母多糖、TLR5 識(shí)別鞭毛蛋白、TLR3 識(shí)別病毒 dsRNA 等，實(shí)現(xiàn) “全熱原覆蓋”。湖州申科生物熱原檢測(cè)試劑盒（MAT法）的驗(yàn)證數(shù)據(jù)顯示，其對(duì)不同濃度非內(nèi)毒素?zé)嵩许憫?yīng)：如 0.1-100μg/mL 鞭毛蛋白可檢測(cè)到 0.005-0.035EU/mL熱原活性，0.1-10μg/mL LTA 對(duì)應(yīng) 0.1-0.7EU/mL 熱原活性，1-100μg/mL 雷西莫特（TLR7/8 配體）對(duì)應(yīng) 0.5-3.0EU/mL 熱原活性。此外，MAT法檢測(cè)的是熱原的生物活性（而非單純 LPS 含量），可避免 LER 導(dǎo)致的假陰性，為CGT等高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品提供更有保障的熱原檢測(cè)方案。

MAT法熱原檢測(cè)中，ELISA 加終止液后的讀數(shù)時(shí)間需嚴(yán)格控制，以保障 IL-6 檢測(cè)信號(hào)穩(wěn)定。湖州申科生物MAT試劑盒說明書明確要求，終止液添加后需在 10 分鐘內(nèi)完成讀數(shù)，且需避光操作 —— 原因在于，終止液（如硫酸）會(huì)終止 TMB 顯色反應(yīng)，但生成的黃色產(chǎn)物在光照下易降解，超過 10 分鐘后 OD 值會(huì)下降，導(dǎo)致 IL-6 檢測(cè)值偏低。讀數(shù)前需進(jìn)行 30 秒震蕩混勻，確?？變?nèi)液體濃度均勻，避免因局部濃度差異導(dǎo)致復(fù)孔 OD 值波動(dòng)。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)需設(shè)置為 450nm，若儀器含 600nm 參考波長(zhǎng)，可同時(shí)檢測(cè) 600nm 波長(zhǎng)以扣除背景干擾（如細(xì)胞碎片導(dǎo)致的光散射），提升檢測(cè)準(zhǔn)確性。需注意的是，讀數(shù)時(shí)不可覆蓋封板膜或蓋子，避免膜上凝結(jié)的水蒸氣滴入孔中，導(dǎo)致 OD 值異常升高。若因儀器故障無法及時(shí)讀數(shù)，需將微孔板密封后置于 4℃避光保存，并在 30 分鐘內(nèi)完成讀數(shù)，同時(shí)在記錄中注明延遲原因，評(píng)估延遲對(duì)結(jié)果的影響（如延遲 20 分鐘，OD 值可能下降 15%，需校正后使用）。

MAT法（單核細(xì)胞活化反應(yīng)測(cè)定）熱原檢測(cè)基于人體免疫反應(yīng)機(jī)制設(shè)計(jì)，原理是：內(nèi)毒素（革蘭氏陰性菌來源）與非內(nèi)毒素?zé)嵩ǜ锾m氏陽性菌、霉菌、病毒等來源）進(jìn)入人體后，會(huì)活化單核細(xì)胞或單核細(xì)胞系，使其釋放 IL-6、IL-1、IL-1β、TNF-α 等促炎細(xì)胞因子。檢測(cè)時(shí)將供試品與單核細(xì)胞 / 單核細(xì)胞系共孵育，再通過 ELISA 定量檢測(cè)釋放的 IL-6 含量，結(jié)合內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)曲，即可判斷供試品中熱原含量是否符合規(guī)定，實(shí)現(xiàn)內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩娜采w檢測(cè)。

MAT 法熱原檢測(cè)背景值偏高會(huì)干擾結(jié)果判讀，需從試劑、操作兩方面解決。試劑相關(guān)問題中，非特異性活化（如試劑含微量熱原）會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞異常分泌 IL-6，需選用低內(nèi)毒素的試劑與耗材；檢測(cè)試劑添加過多（如抗體濃度過高）會(huì)增加非特異性結(jié)合，需按說明書稀釋試劑或降低推薦濃度。操作環(huán)節(jié)問題更多見：孔洗滌不充分會(huì)殘留未結(jié)合抗體與酶，需按方案完成規(guī)定洗滌次數(shù)（如 3-5 次），確保洗滌液充分浸潤(rùn)孔底；洗滌緩沖液污染（如滋生微生物）會(huì)引入外源信號(hào)，需現(xiàn)配現(xiàn)用緩沖液；加終止液后讀板延遲（超 10 分鐘），會(huì)因黃色產(chǎn)物降解導(dǎo)致背景虛高，需加終止液后立即讀板；底物孵育時(shí)見光會(huì)引發(fā)非特異性顯色，需在避光環(huán)境下進(jìn)行 TMB 孵育；孔板底部臟（如殘留指紋、液體痕跡）會(huì)影響光吸收，需用無塵紙清潔孔板底部后再讀板。通過以上措施，可有效降低背景值，確保檢測(cè)信號(hào)的真實(shí)性，避免因背景干擾導(dǎo)致熱原濃度誤判。