江蘇疫苗熱原檢測方法驗(yàn)證
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發(fā)布時(shí)間:2025-09-29
熱原是能引發(fā)恒溫動物體溫異常升高的物質(zhì)總稱,主要成分為細(xì)菌內(nèi)毒素(革蘭氏陰性菌脂多糖 LPS),同時(shí)涵蓋病毒、真菌毒素、支原體等非內(nèi)毒素?zé)嵩?,其檢測是保障藥品與醫(yī)療器械安全性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)前熱原檢測已形成 “特異性檢測 + 廣譜篩查” 互補(bǔ)的完整體系:以鱟試驗(yàn)法(含天然 LAL 與重組 rCR/rFC 試劑)作為細(xì)菌內(nèi)毒素的特異性檢測手段,憑借 fg 級靈敏度成為制藥行業(yè)常規(guī)質(zhì)控方法,可通過凝膠法實(shí)現(xiàn)定性、動態(tài)濁度 / 顯色法完成定量;以家兔熱原試驗(yàn)作為傳統(tǒng)廣譜篩查方法,雖操作繁瑣(需預(yù)試篩選基礎(chǔ)體溫穩(wěn)定家兔,正式試驗(yàn)觀察 3 小時(shí)體溫變化),但仍是放射性質(zhì)的藥物、血液制品等高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品排除非內(nèi)毒素?zé)嵩难a(bǔ)充手段;以單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定(MAT)作為新興全熱原檢測技術(shù),利用人源單核細(xì)胞(如 THP-1 細(xì)胞)釋放 IL-6、TNF-α 等細(xì)胞因子的特性,可同時(shí)識別內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩?,契合疫苗、基因治療產(chǎn)品等對風(fēng)險(xiǎn)控制的需求。三種方法協(xié)同應(yīng)用,從原料入廠到成品放行構(gòu)建全流程熱原防控網(wǎng)絡(luò),既保證對內(nèi)毒素的準(zhǔn)確監(jiān)控,又避免非內(nèi)毒素?zé)嵩倪z漏風(fēng)險(xiǎn)。
當(dāng)熱原侵入人體循環(huán)系統(tǒng),單核細(xì)胞表面的TLR即刻化身分子雷達(dá),準(zhǔn)確捕獲LPS、LTA等外源致熱物。江蘇疫苗熱原檢測方法驗(yàn)證
PyroSHENTEK®熱原檢測試劑盒(貨號 1502100,規(guī)格 96 測試 / 盒)優(yōu)勢在于搭載 MAT 特定單核細(xì)胞系,細(xì)胞表面表達(dá)多種 Toll 樣受體(TLR),可響應(yīng)不同類型熱原。該細(xì)胞系來源清晰、可溯源,均一性強(qiáng)且無供體依賴,有效規(guī)避了傳統(tǒng) PBMC 因供體差異導(dǎo)致的結(jié)果波動,同時(shí)安全風(fēng)險(xiǎn)低,無需擔(dān)憂外源因子污染。試劑盒采用 “標(biāo)準(zhǔn)化單核細(xì)胞 + ELISA 檢測” 一體化體系,通過嚴(yán)格的細(xì)胞質(zhì)量控制(如凍存復(fù)融后活率達(dá)標(biāo)),確保每次檢測的細(xì)胞狀態(tài)一致;搭配預(yù)包被 IL-6 抗體的酶標(biāo)板與配套試劑,進(jìn)一步減少體系誤差。從標(biāo)曲數(shù)據(jù)來看,其擬合采用 4-Parameter Logistic 模型,R2 達(dá) 1.000,EC50 為 0.119EU/mL,參數(shù)置信區(qū)間穩(wěn)定,復(fù)孔結(jié)果重復(fù)性優(yōu)異,能為熱原定量提供準(zhǔn)確如一的數(shù)據(jù)支撐,避免因體系不穩(wěn)定導(dǎo)致的檢測偏差。
上海非動物源熱原檢測風(fēng)險(xiǎn)評估家兔法是熱原檢測 “金標(biāo)準(zhǔn)”,但操作繁瑣、耗時(shí)且需動物設(shè)施,存在明顯局限。
MAT法熱原檢測中,ELISA 加終止液后的讀數(shù)時(shí)間需嚴(yán)格控制,以保障 IL-6 檢測信號穩(wěn)定。湖州申科生物MAT試劑盒說明書明確要求,終止液添加后需在 10 分鐘內(nèi)完成讀數(shù),且需避光操作 —— 原因在于,終止液(如硫酸)會終止 TMB 顯色反應(yīng),但生成的黃色產(chǎn)物在光照下易降解,超過 10 分鐘后 OD 值會下降,導(dǎo)致 IL-6 檢測值偏低。讀數(shù)前需進(jìn)行 30 秒震蕩混勻,確??變?nèi)液體濃度均勻,避免因局部濃度差異導(dǎo)致復(fù)孔 OD 值波動。酶標(biāo)儀波長需設(shè)置為 450nm,若儀器含 600nm 參考波長,可同時(shí)檢測 600nm 波長以扣除背景干擾(如細(xì)胞碎片導(dǎo)致的光散射),提升檢測準(zhǔn)確性。需注意的是,讀數(shù)時(shí)不可覆蓋封板膜或蓋子,避免膜上凝結(jié)的水蒸氣滴入孔中,導(dǎo)致 OD 值異常升高。若因儀器故障無法及時(shí)讀數(shù),需將微孔板密封后置于 4℃避光保存,并在 30 分鐘內(nèi)完成讀數(shù),同時(shí)在記錄中注明延遲原因,評估延遲對結(jié)果的影響(如延遲 20 分鐘,OD 值可能下降 15%,需校正后使用)。
PBMC(外周血單個(gè)核細(xì)胞)的復(fù)雜制備流程嚴(yán)重制約熱原檢測效率。首先,血源獲取受獻(xiàn)血者數(shù)量、時(shí)間及采集血液政策限制,無法按需即時(shí)獲取;其次,需嚴(yán)格執(zhí)行 EP2.6.30 規(guī)定的標(biāo)志物檢測,增加前期準(zhǔn)備時(shí)間;再進(jìn)行采集血液、分離單核細(xì)胞、凍存等環(huán)節(jié)需全程無菌操作,步驟繁瑣且易引入污染風(fēng)險(xiǎn)。相比之下,單核細(xì)胞系可工業(yè)化培養(yǎng),制備流程簡單可控,能快速提供合格細(xì)胞,避免因 PBMC 制備延誤熱原檢測進(jìn)度,更適配批量樣品的高效質(zhì)控。中國藥典9301已將MAT列為熱原檢測的補(bǔ)充方法,美國藥典鼓勵(lì)企業(yè)采用經(jīng)過驗(yàn)證的MAT替代家兔法。
湖州申科生物熱原檢測試劑盒(MAT 法,貨號 1502100)包含完整的檢測體系,組分按功能可分為細(xì)胞培養(yǎng)類、ELISA 檢測類與輔助類,且儲存條件明確。細(xì)胞培養(yǎng)類組分包括:2-8℃儲存的培養(yǎng)液(25mL×2 瓶)、96 孔細(xì)胞孵育板,-18℃儲存的培養(yǎng)液添加劑(1.5mL×1 管)、細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品,以及需液氮保存的 MAT 細(xì)胞(2 支),確保細(xì)胞活性與穩(wěn)定性。ELISA 檢測類組分涵蓋:2-8℃儲存的生物素偶聯(lián)抗 IL-6 抗體(200×,60μL)、鏈霉親和素 HRP 復(fù)合物(100×,140μL)、TMB 顯色液(12mL)、終止液(6mL),以及抗 IL-6 預(yù)包被酶標(biāo)板(8 孔 ×12 條),無需額外制備抗體,即開即用。輔助類組分包括細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(8mL×1 管)、稀釋液(25mL)、濃縮緩沖液(10×,25mL×2 瓶)與封板膜,滿足從樣品稀釋到檢測終止的全流程需求。各組分儲存條件嚴(yán)格區(qū)分,避免因儲存不當(dāng)導(dǎo)致性能下降,保障檢測結(jié)果可靠。
熱原進(jìn)入血液后,TLR信號迅速活化NF-κB通路,驅(qū)動單核細(xì)胞釋放IL-1β、IL-6、TNF-α因子風(fēng)暴。北京原料藥熱原檢測結(jié)果判定
熱原檢測MAT零動物消耗,降低檢測成本,提升檢測效率和倫理水平。江蘇疫苗熱原檢測方法驗(yàn)證
MAT法熱原檢測特定標(biāo)準(zhǔn)品與傳統(tǒng)細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品存在本質(zhì)差異,需明確區(qū)分以保障檢測準(zhǔn)確性。MAT 特定標(biāo)準(zhǔn)品為大腸桿菌(E.coli 0113:H10:K)菌株制備,經(jīng)全國 5 家藥品檢驗(yàn)所(含中檢院)用凝膠法、動態(tài)濁度法及動態(tài)顯色法協(xié)作標(biāo)定,溯源至國際標(biāo)準(zhǔn)品,可同時(shí)檢測內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩?;而傳統(tǒng)細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品(如 9000EU 規(guī)格)源自大腸桿菌(E.coli O111:B4),只適用于內(nèi)毒素檢測,無法識別非內(nèi)毒素?zé)嵩?。關(guān)鍵驗(yàn)證數(shù)據(jù)顯示,用 MAT法檢測 9000EU 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品時(shí),加標(biāo)回收率不在 50%-200% 的合格范圍,因此不能替代 MAT 特定標(biāo)準(zhǔn)品。值得注意的是,盡管 MAT 試劑盒用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)曲,但經(jīng)驗(yàn)證其可識別非內(nèi)毒素?zé)嵩魳悠分写嬖诜莾?nèi)毒素?zé)嵩ㄈ绺锾m氏陽性菌的脂磷壁酸),會觸發(fā)細(xì)胞陽性反應(yīng),有效避免漏檢,這也是 MAT 法在熱原防控中優(yōu)于單一內(nèi)毒素檢測的關(guān)鍵優(yōu)勢。
江蘇疫苗熱原檢測方法驗(yàn)證