細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個(gè)大坑:1.準(zhǔn)備不足做脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的時(shí)候,在開(kāi)展正式實(shí)驗(yàn)前要多做預(yù)試驗(yàn),優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件包括:脂質(zhì)體的用量、DNA密度、細(xì)胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時(shí)間等等。2.電壓過(guò)大做電轉(zhuǎn)的時(shí)候,如果電壓太大,往往會(huì)發(fā)生細(xì)胞大量死亡的情況。...
轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng):有血清時(shí)的轉(zhuǎn)染血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率,但只要在DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時(shí)不含血清,在轉(zhuǎn)染過(guò)程中是可以使用血清的。轉(zhuǎn)染過(guò)程在兩步中需要使用培養(yǎng)基做為稀釋液:在DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物準(zhǔn)備過(guò)程以及復(fù)合物同細(xì)胞接觸過(guò)程。在開(kāi)始準(zhǔn)備DN...
細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介:實(shí)驗(yàn)材料與器材:1、材料293T細(xì)胞、MyoD表達(dá)質(zhì)粒和EGFP表達(dá)質(zhì)粒、DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素/青霉素(雙抗)、FCS(小牛血清)、PBS(磷酸鹽緩沖溶液)、胰酶/EDTA消化液、轉(zhuǎn)染試劑(TransFast)2、器材20ul/200ul/...
細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng):物品(PS)物品,比如青霉素和鏈霉素,是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對(duì)于真核細(xì)胞無(wú)毒,但陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,使物品可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以,在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用物品,甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)...
細(xì)胞轉(zhuǎn)染那些事兒:1.設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照:一般在轉(zhuǎn)染后24-48h,靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)??梢罁?jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?4-48h后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。2.轉(zhuǎn)染后效率的檢測(cè)方法:觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光情況;qPCR驗(yàn)證;WB檢測(cè)敲減或過(guò)表達(dá)蛋白。3.轉(zhuǎn)染效率...
細(xì)胞電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的幾點(diǎn)建議:1.電場(chǎng)強(qiáng)度要合適合適的電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)于電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)非常重要,電場(chǎng)強(qiáng)度不能過(guò)高,過(guò)高會(huì)增加細(xì)胞的死亡率;也不能過(guò)低,過(guò)低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細(xì)胞系具有不同的較佳場(chǎng)強(qiáng)值,實(shí)驗(yàn)前應(yīng)測(cè)定所轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的較佳電場(chǎng)強(qiáng)度。2.細(xì)胞狀態(tài)...
方法使用光鏡和HE染色對(duì)自制染色干燥ECM-AM進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,并通過(guò)免疫熒光染色對(duì)比其與單純凍干羊膜中不同生物活性因子Laminin5、β-catenin和CollagenⅣ的表達(dá)情況。利用負(fù)荷傳感器對(duì)比自制染色干燥ECM-AM與單純凍干羊膜的較大承受拉伸力...
凍存細(xì)胞注意事項(xiàng):冷凍保護(hù)劑可降低培養(yǎng)基的冰點(diǎn),并可減緩冷卻速度,較大降低冰晶形成的危險(xiǎn)(冰晶可損傷細(xì)胞,導(dǎo)致細(xì)胞死亡)。注:DMSO可促進(jìn)有機(jī)分子進(jìn)入組織。操作含DMSO的試劑時(shí),應(yīng)采用與此類物質(zhì)安全危害相適應(yīng)的設(shè)備和操作規(guī)范,并應(yīng)按照當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)處置此類試劑。...
無(wú)血清細(xì)胞凍存液:產(chǎn)品介紹:無(wú)血清細(xì)胞凍存液是一款針對(duì)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇所研發(fā)的即用型細(xì)胞凍存液。該凍存液采用獨(dú)特的凍存配方,包括DMSO在內(nèi)的凍存保護(hù)劑復(fù)合物,**降低了細(xì)胞在凍存過(guò)程中冰晶對(duì)于細(xì)胞的損傷。凍存液中添加了葡萄糖,氨基酸等各種細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)成分,***提...
表皮細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)由基底膜組成,分隔真皮和表皮,與真皮成纖維細(xì)胞和表皮角質(zhì)形成細(xì)胞形成細(xì)胞外微環(huán)境。ECM的功能包括細(xì)胞粘附和支持、細(xì)胞間通訊、細(xì)胞分化調(diào)節(jié),以及所有與正常(穩(wěn)態(tài)和衰老)和病理(傷口愈合、化生或惡性)相關(guān)的過(guò)程。許多研究強(qiáng)調(diào)了ECM在調(diào)控...
這種轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種入正常機(jī)體,常能長(zhǎng)成塊,并侵潤(rùn)正常組織,發(fā)生普遍轉(zhuǎn)移。如何理解細(xì)胞外基質(zhì)影響細(xì)胞的粘附過(guò)程:1.決定細(xì)胞的形狀體外實(shí)驗(yàn)證明,各種細(xì)胞脫離了細(xì)胞外基質(zhì)呈單個(gè)游離狀態(tài)時(shí)多呈球形.同一種細(xì)胞在不同的細(xì)胞外基質(zhì)上粘附時(shí)可表現(xiàn)出完全不同的形狀.上皮細(xì)胞粘...
拭子RNA提取試劑的選擇?操作簡(jiǎn)便性。操作簡(jiǎn)便性也是拭子RNA提取試劑選擇的一個(gè)重要因素。操作過(guò)于復(fù)雜,不光費(fèi)時(shí)費(fèi)力,還容易導(dǎo)致樣本間的交叉污染,也容易損失樣本。特別是用于臨床檢測(cè)或樣本量較多情況下的檢測(cè),操作復(fù)雜如果導(dǎo)致交叉污染會(huì)引起誤診,還會(huì)影響出檢測(cè)報(bào)告...
構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的大分子:原膠原共價(jià)交聯(lián)后成為具有抗張強(qiáng)度的不溶性膠原。胚胎及新生兒的膠原因缺乏分子間的交聯(lián)而易于抽提。隨年齡增長(zhǎng),交聯(lián)日益增多,皮膚、血管及各種組織變得僵硬,成為老化的一個(gè)重要特征。人α1(Ⅰ)鏈的基因含51個(gè)外顯子,因而基因轉(zhuǎn)錄后的拼接十分復(fù)...
細(xì)胞RNA提取的方法:實(shí)驗(yàn)提取步驟:標(biāo)準(zhǔn)Trizol提取步驟為液氮研磨--加入Trizol裂解--加入氯仿抽提--離心--加入氯丙醇沉淀--離心--酒精洗滌--離心。將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于冰上,加入Trizol裂解5-10分鐘,用泵頭輕輕吹打后吸取液體放入進(jìn)口EP管...
細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚糖(proteoglycan):蛋白聚糖是氨基聚糖(除透明質(zhì)酸外)與中心蛋白質(zhì)(coreprotein)的共價(jià)結(jié)合物。中心蛋白質(zhì)的絲氨酸殘基(常有Ser-Gly-X-Gly序列)可在高爾基復(fù)合體中裝配上氨基聚糖(GAG)鏈。其糖基化過(guò)程為通過(guò)逐...
細(xì)胞外基質(zhì)的成分:構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的大分子種類繁多,可大致歸納為四大類:膠原、非膠原糖蛋白、氨基聚糖與蛋白聚糖、以及彈性蛋白。上皮組織、肌組織及腦與脊髓中的ECM含量較少,而結(jié)締組織中ECM含量較高。細(xì)胞外基質(zhì)的組分及組裝形式由所產(chǎn)生的細(xì)胞決定,并與組織的特殊功...
長(zhǎng)期的促炎反應(yīng)會(huì)阻礙巨噬細(xì)胞從M1到M2的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致骨再生延遲。因此,在骨損傷早期通過(guò)調(diào)控M1向M2的轉(zhuǎn)變來(lái)適時(shí)終止促炎反應(yīng)是骨愈合成功的前提。近日,浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院范順武和林賢豐教授課題組制備了一種骨膜來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)(PEM)水凝膠,并評(píng)價(jià)了它們?cè)诠切迯?fù)過(guò)程中...
血漿/血清中miRNA提取試劑盒:是專門針對(duì)血清、血漿樣本中miRNA提取而開(kāi)發(fā)的,利用吸附柱法從血清、血漿樣品中簡(jiǎn)單快捷提取高純度高質(zhì)量的miRNA。該試劑盒中的裂解液miRBP1及柱結(jié)合液miRBP2具有高效裂解及提取效果。試劑盒中的吸附柱采用特殊的硅基質(zhì)...
總RNA提取試劑,適用于動(dòng)植物細(xì)胞或組織及細(xì)菌的總RNA抽提,可有效防止RNA在提取過(guò)程中的降解。獲得的RNA可直接用于Northern雜交,純化mRNA,體外翻譯,RNase保護(hù)實(shí)驗(yàn),RT-PCR以及cDNA克隆等一系列操作。該試劑可用于100次總RNA提取...
無(wú)血清細(xì)胞凍存液,含多種保護(hù)劑成分。一些保護(hù)劑,易于穿透細(xì)胞,避免細(xì)胞內(nèi)部水分子形成冰晶損傷細(xì)胞,同時(shí)另一些保護(hù)劑不能穿透細(xì)胞,但可以在冰晶形成之前,優(yōu)先結(jié)合細(xì)胞外的水分子,降低細(xì)胞外溶液的電解質(zhì)濃度,減少陽(yáng)離子進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量,為多種保護(hù)劑組合,在細(xì)胞內(nèi)外進(jìn)行...
細(xì)胞外基質(zhì)層粘連蛋白:(laminin,LN)LN也是一種大型的糖蛋白,與Ⅳ型膠原一起構(gòu)成基膜,是胚胎發(fā)育中出現(xiàn)較早的細(xì)胞外基質(zhì)成分。LN分子由一條重鏈(α)和二條輕鏈(β、γ)借二硫鍵交聯(lián)而成,外形呈十字形,三條短臂各由三條肽鏈的N端序列構(gòu)成。每一短臂包括二...
無(wú)血清快速細(xì)胞凍存液,是一種新型的快速凍存細(xì)胞的保護(hù)液,可將細(xì)胞置于-80^C直接冷凍保存。NM4100內(nèi)含天然抗凍蛋白(Naturalantifrereprotein),不含動(dòng)物來(lái)源的血清成分,能夠有效提高細(xì)胞凍存活率和復(fù)蘇活力,減少各類病毒、霉菌和支原體等...
無(wú)血清細(xì)胞凍存液:采用patent的凍存配方,用包括重組人血白蛋白等多種蛋白組分替代了血清的用途。用包括DMSO在內(nèi)的復(fù)合凍存保護(hù)劑替代了單一的DMSO的保護(hù)作用。復(fù)合保護(hù)劑的內(nèi)部保護(hù)劑,易于穿透細(xì)胞膜,避免在細(xì)胞凍存過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)部的水分子形成冰晶損傷細(xì)胞;外...
目前,主流的RNA提取方法有Trizol法、離心柱法和磁珠法。其中,Trizol法與離心柱法相比,提取效果相當(dāng),但因其對(duì)操作者帶來(lái)的毒性,現(xiàn)在越來(lái)越被棄用。磁珠法可以針對(duì)大批量樣本處理,適合機(jī)器自動(dòng)化提取,但是提取核酸純度低,提取得率低,且使用成本較高。對(duì)于拭...
細(xì)胞外基質(zhì)的主要類型及功能:a.骨的胞外基質(zhì)表現(xiàn)為剛硬的特點(diǎn),以滿足支撐的作用b.軟骨是另一種結(jié)締組織,其胞外基質(zhì)具有一定的韌性c.眼角膜中胞外基質(zhì)是透明的保護(hù)層。如前所述,動(dòng)物組織的構(gòu)建既是多細(xì)胞相互作用的結(jié)果,也是細(xì)胞與胞外基質(zhì)相互作用和接觸的結(jié)果。胞外基...
無(wú)血清快速細(xì)胞凍存液凍存細(xì)胞復(fù)蘇方法:1、從冰箱里取出細(xì)胞冷凍保存管,立即放入37℃振動(dòng)水浴槽中快速解凍。2、待凍存管中細(xì)胞混合液完全融化后,立即加入1ml細(xì)胞培養(yǎng)基于該冷凍管中與細(xì)胞混合,再將細(xì)胞混合液從凍存管中移入含有9ml該細(xì)胞培養(yǎng)基的試管中,混合均勻。...
蛋白聚糖在細(xì)胞外基質(zhì)中的功能是什么:。單個(gè)的蛋白聚糖和透明質(zhì)酸-蛋白聚糖復(fù)合物直接與膠原纖維連接形成動(dòng)物細(xì)胞外的纖維-網(wǎng)絡(luò)(fiber-network)結(jié)構(gòu),不同類型的膠原和不同類型的蛋白聚糖連接形成不同的纖維-網(wǎng)絡(luò),對(duì)于提高細(xì)胞外基質(zhì)的連貫性起關(guān)鍵作用。此外...
免疫系統(tǒng)和細(xì)胞外基質(zhì)之間的串?dāng)_:ECM是三維網(wǎng)狀,支持細(xì)胞,調(diào)節(jié)重要的細(xì)胞過(guò)程:增殖,粘附,遷移,細(xì)胞分化和炎癥。在對(duì)損傷的反應(yīng)中,首先發(fā)生的事件包括免疫系統(tǒng)的啟動(dòng)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的上調(diào)。細(xì)胞對(duì)損傷信號(hào)的反應(yīng)進(jìn)程和較終結(jié)果在一定程度上受創(chuàng)床中存在的...
細(xì)胞外基質(zhì)成分居然能調(diào)節(jié)葡萄糖代謝過(guò)程:鑒于錨定非依賴性生長(zhǎng)對(duì)部位發(fā)生的重要性,已經(jīng)描述了基質(zhì)附著的分類變化及其代謝影響。透明質(zhì)酸(HA,或透明質(zhì)酸),一種普遍存在的ECM成分,是一種巨型醇胺糖胺聚糖,通過(guò)與其質(zhì)膜(PM)受體,CD44和HA介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)受體(H...
細(xì)胞外基質(zhì)層粘連蛋白:(laminin,LN)LN也是一種大型的糖蛋白,與Ⅳ型膠原一起構(gòu)成基膜,是胚胎發(fā)育中出現(xiàn)較早的細(xì)胞外基質(zhì)成分。LN分子由一條重鏈(α)和二條輕鏈(β、γ)借二硫鍵交聯(lián)而成,外形呈十字形,三條短臂各由三條肽鏈的N端序列構(gòu)成。每一短臂包括二...